3. 結(jié)果與討論

3.1. SERS基底的表征

AgNPs通過檸檬酸鈉還原法制備，其等離子體共振帶位于450 nm（圖1B）。由于檸檬酸配體覆蓋了AgNPs的表面，它們帶負(fù)電荷。因此，我們采用層層組裝法，以帶正電荷的聚電解質(zhì)（PDDA）為橋梁，將銀納米粒子固定在玻璃基底上。通過SEM（圖1C）表征了該SERS活性基底，結(jié)果顯示AgNPs均勻分散在玻璃基底上。AgNPs的平均直徑約為70 nm，形狀主要為球形，部分為棒狀。

SERS基底用4-MPY作為報(bào)告分子進(jìn)行修飾。4-MPY的巰基末端與銀表面結(jié)合，而另一端吡啶的質(zhì)子化改變了與4-MPY分子吡啶環(huán)相關(guān)的振動模式，從而實(shí)現(xiàn)傳感。我們首先記錄了4-MPY的光譜輪廓（圖1D）。測得的信號具有典型的4-MPY指紋特征，可以很好地識別。1091和1580 cm-1處的譜帶分別對應(yīng)于環(huán)呼吸振動模式和C=C拉伸振動模式。在本研究中，采用這兩個峰的峰強(qiáng)度比進(jìn)行pH傳感。眾所周知，SERS是一種散射效應(yīng)，絕對信號強(qiáng)度會受到許多因素影響。例如，干燥過程會導(dǎo)致原始信號波動；然而，它對相對強(qiáng)度影響較小，因?yàn)橄鄬ERS強(qiáng)度源于分子構(gòu)型和質(zhì)子化程度。因此，我們選擇比值測量方式，可以在定量分析中獲得更可靠的結(jié)果。

3.2. 響應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

為了減少手術(shù)中因邊界檢測浪費(fèi)的時(shí)間并降低麻醉風(fēng)險(xiǎn)，我們優(yōu)化了SERS響應(yīng)時(shí)間。響應(yīng)酸性條件，4-MPY吡啶基團(tuán)會發(fā)生質(zhì)子化，如圖3A所示，這會導(dǎo)致SERS譜帶變化。SERS隨時(shí)間響應(yīng)的反饋如圖S1所示。圖3B繪制了4-MPY兩個特征峰的比值變化（I1091/I1580）?？梢钥闯觯?dāng)連續(xù)采集光譜延長至10分鐘時(shí)，兩個特征峰的比值I1091/I1580開始保持不變，表明在本例中SERS檢測時(shí)間閾值為10分鐘。

3.3. 不同pH條件下4-MPY的測定

評估了SERS傳感芯片的pH響應(yīng)特性。用傳感芯片測試了pH范圍為5.5-7.5的標(biāo)準(zhǔn)pH緩沖溶液。在每個不同pH下隨機(jī)采集8個點(diǎn)的SERS光譜。對獲得的原始光譜進(jìn)行基線扣除處理。如圖3C所示，隨著pH值增加，1580 cm-1處的峰強(qiáng)度逐漸增加，而1091 cm-1處對應(yīng)的峰強(qiáng)度逐漸減小，這可以通過4-MPY的N-質(zhì)子化和去質(zhì)子化來解釋。繪制了這些譜帶在不同pH條件下的比值，并用線性方程進(jìn)行了擬合，擬合公式為y=-0.15x+2.35（圖3D）。因此，建立了I1091/I1580值與pH之間的關(guān)系，可作為測量組織樣品微酸性環(huán)境的校準(zhǔn)曲線。

圖3. A) 吡啶分子結(jié)構(gòu)在酸性和堿性條件下變化的示意圖。B) 不同響應(yīng)時(shí)間下獲取的相同pH條件下4- MPY 兩個特征峰（I1093/I1584）的比值。C) 4- MPY 在不同pH緩沖液中響應(yīng)的SERS光譜。D) 4- MPY 兩個特征峰（I1093/I1584）的比值及其pH值與線性擬合曲線。

3.4. 膠質(zhì)瘤組織的pH響應(yīng)

將上述SERS芯片用于膠質(zhì)瘤組織間液的測量。首先，通過細(xì)胞懸液植入法將U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液注射到胸腺切除小鼠的上肢腋下。培養(yǎng)14天后，獲得約1.0 cm3的膠質(zhì)瘤。在局部麻醉下，將小鼠異位膠質(zhì)瘤細(xì)胞完全剝離。為了收集小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞微環(huán)境的局部pH值，將4.0 μL水滴滴在小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面，以將組織間液提取到水滴中。10秒后，用移液器重新吸取，然后重新滴在SERS基底上進(jìn)行SERS測量。收集小鼠膠質(zhì)瘤的四個不同位置，并在每個位置測量10個SERS光譜。從結(jié)果中我們可以觀察到4-MPY具有很高的SERS活性，其信號在記錄的SERS譜圖中占主導(dǎo)。計(jì)算了I1091/I1580的比值，并獲得了相應(yīng)的pH值（圖4）。可以看出，膠質(zhì)瘤的局部微環(huán)境呈酸性。隨著測量位置接近腫瘤邊緣，腫瘤的pH值逐漸升高。因此，我們可以推斷該技術(shù)可用于確定腫瘤邊界。當(dāng)微環(huán)境的局部pH處于生理范圍（7.35~7.45）內(nèi)或大于此范圍時(shí)，證明腫瘤尚未侵入該區(qū)域，手術(shù)中可以保留該區(qū)域組織。

圖4. 在小鼠膠質(zhì)瘤不同位置測量的特征峰比（I1091/I1580）及其對應(yīng)的pH值。

還通過微電極測量了小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞局部組織間液的pH值。使用顯微操作平臺（圖5A）固定電極，操作標(biāo)準(zhǔn)電極尖端插入腫瘤。在測試真實(shí)組織之前，用四種不同的pH緩沖溶液校準(zhǔn)微電極。獲得了標(biāo)準(zhǔn)微電極曲線，其公式為y=2.15x+77.87（圖5B）。通過4次平行試驗(yàn)（圖5C）可以觀察到該裝置的重現(xiàn)性。將獲得的電位差代入上述公式計(jì)算，結(jié)果如圖5D所示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在同一位置，SERS技術(shù)測量的pH值與微電極直接獲得的結(jié)果具有良好的一致性，其差異僅在pH值的0.1-0.2范圍內(nèi)，表明SERS測量pH是有效和準(zhǔn)確的。

圖5. A) 微操作平臺系統(tǒng)。B) 微電極pH檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。C) 使用微電極測量時(shí)，小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞不同位置對應(yīng)的電位差。D) 通過PH微電極測量的小鼠膠質(zhì)瘤不同位置pH值與SERS方法測量結(jié)果的對比。

4. 結(jié)論

通過開發(fā)一種比值SERS方法，建立了測量膠質(zhì)瘤組織間液微酸性環(huán)境的實(shí)驗(yàn)方法。通過對小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的檢測，證明該方法合理且可重復(fù)。SERS報(bào)告分子可以響應(yīng)局部pH值，從而區(qū)分腫瘤組織和正常組織，這已通過微電極系統(tǒng)得到證實(shí)。該技術(shù)也避免了其他需要將pH敏感探針注射入患者血液中的方法所帶來的風(fēng)險(xiǎn)和副作用。測試僅需幾秒鐘，適用于快速術(shù)中病理學(xué)檢查。憑借其簡便、快速和無創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn)，這種SERS策略可作為一種區(qū)分膠質(zhì)瘤邊界的新手段。該技術(shù)使外科醫(yī)生能夠在可視化環(huán)境下盡可能多地切除腫瘤組織，同時(shí)保留更多功能性組織，這對于腦腫瘤患者具有重要意義，能夠提供更多機(jī)會并提高術(shù)后生存率和患者生活質(zhì)量。