摘要

背景：腦間質(zhì)pH（pHbrain）改變在圍產(chǎn)期窒息引起的新生兒缺氧缺血性腦病（HIE）的神經(jīng)元損傷機(jī)制中起重要作用。新生豬是研究HIE的成熟大動(dòng)物模型，但關(guān)于該物種pHbrain改變的信息有限，且僅限于實(shí)驗(yàn)性圍產(chǎn)期窒息（PA）和立即復(fù)蘇階段。因此，我們旨在測定仔豬HIE發(fā)展最初24小時(shí)內(nèi)的pHbrain變化。

方法：對麻醉、通氣的新生豬（n=16）進(jìn)行器械操作以控制主要生理參數(shù)。使用pH微電極在頂葉皮層測定pHbrain。通過用含6%O?-20%CO?的氣體混合物通氣20分鐘誘導(dǎo)PA，然后用空氣復(fù)蘇24小時(shí)，隨后對腦組織進(jìn)行組織病理學(xué)評估。

結(jié)果：在PA期間，核心溫度保持不變（基線versus PA結(jié)束時(shí)：38.4±0.1 vs 38.3±0.1°C；平均值±SEM）。在動(dòng)脈血中，PA導(dǎo)致嚴(yán)重低氧血癥（PaO?:65±4 vs 23±1 mmHg,p<0.05）以及酸中毒（pHa:7.53±0.03 vs 6.79±0.02），這與觀察到的高碳酸血癥（PaCO?:37±3 vs 160±6 mmHg）和乳酸血癥（1.6±0.3 vs 10.3±0.7 mmol/L）一致。同時(shí)，pHbrain從7.21±0.03逐漸下降至5.94±0.11*。復(fù)蘇在4小時(shí)內(nèi)恢復(fù)了pHa、血?dú)饧按x物水平，但PaCO?仍略有升高。pHbrain在29.4±5.5分鐘內(nèi)恢復(fù)至7.0，隨后恢復(fù)至基線水平，并在24小時(shí)觀察期內(nèi)未出現(xiàn)繼發(fā)性改變。神經(jīng)病理學(xué)評估也證實(shí)了神經(jīng)元損傷。

結(jié)論：盡管在實(shí)驗(yàn)性PA期間存在嚴(yán)重酸中毒和血?dú)飧淖儯玴Hbrain恢復(fù)迅速，且值得注意的是，未出現(xiàn)許多HIE嬰兒中常見的窒息后低碳酸血癥。因此，在我們的仔豬模型中，神經(jīng)元損傷與PA后最初24小時(shí)內(nèi)異常的pHbrain或低PaCO?無關(guān)。

引言

圍產(chǎn)期窒息（PA）定義為分娩前后氧氣供應(yīng)中斷，是全球新生兒死亡和長期神經(jīng)殘疾的主要原因之一。胎盤或肺氣體交換中斷會(huì)立即引發(fā)代謝改變（低氧血癥、高碳酸血癥和混合性酸中毒），從而觸發(fā)心血管反應(yīng)，以利于維持心肌和大腦（即中心循環(huán)）的氧氣輸送。當(dāng)這些代償機(jī)制耗盡時(shí)，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的組織缺氧/缺血，隨后的代謝危象將導(dǎo)致存活者出現(xiàn)缺氧缺血性腦病（HIE）。

盡管治療性低溫在減輕PA/HIE不良結(jié)局方面具有部分療效，但仍需要臨床前動(dòng)物模型來研究HIE發(fā)展的精確病理生理學(xué)，并測試推定的神經(jīng)保護(hù)方法。與人類PA/HIE綜合征的病因、嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間異質(zhì)性類似，臨床前模型在物種、動(dòng)物的產(chǎn)前/產(chǎn)后年齡、誘導(dǎo)PA/HIE的方法以及窒息后觀察期的長度方面也存在相當(dāng)大的異質(zhì)性。這些差異使得積累的數(shù)據(jù)不易比較和轉(zhuǎn)化。新生豬長期以來被確定并接受作為研究足月新生兒的通用臨床前模型。兩個(gè)物種在大腦結(jié)構(gòu)、代謝、發(fā)育以及腦血管生理學(xué)方面存在許多重要的相似之處，這使得仔豬適合進(jìn)行轉(zhuǎn)化性PA/HIE研究。我們最近發(fā)表了一種新生仔豬PA/HIE模型，該模型產(chǎn)生了人類PA/HIE的主要特征，并能引發(fā)顯著的神經(jīng)元損傷，但未包含在人類中從未或極少發(fā)生的操作，如雙側(cè)頸動(dòng)脈閉塞或短暫性出血性低血壓。

在本研究中，我們著手研究仔豬模型中PA期間和HIE發(fā)展亞急性期腦間質(zhì)pH（pHbrain）的變化過程。在HIE患者中，使用磁共振波譜（MRS）技術(shù)在年齡<2周時(shí)發(fā)現(xiàn)腦細(xì)胞內(nèi)pH（pHi）水平相當(dāng)高。這種堿中毒持續(xù)數(shù)月并與不良神經(jīng)結(jié)局相關(guān)，所描述的pH改變可能是所謂的繼發(fā)性能量衰竭的特征之一。然而，pHi的變化可能不能真實(shí)反映pHbrain的改變，因?yàn)榭缒H梯度在HIE發(fā)展過程中會(huì)發(fā)生改變，而且細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外pH通過不同的靶點(diǎn)改變大腦活動(dòng)和能量消耗。關(guān)于PA/HIE引起的仔豬pHbrain變化的數(shù)據(jù)非常有限，并且這些研究未能在缺氧缺血應(yīng)激完成后4小時(shí)之后追蹤pHbrain的進(jìn)程。我們現(xiàn)在在我們充分表征的仔豬PA/HIE模型中報(bào)告定量腦皮質(zhì)pHbrain數(shù)據(jù)，包括PA期間和HIE發(fā)展的最初24小時(shí)。

材料與方法

所有涉及動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)過三步流程批準(zhǔn)。首先，詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃由塞格德大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)（IACUC）仔細(xì)審查并批準(zhǔn)。其次，向國家動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)請求批準(zhǔn)IACUC認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃。第三，匈牙利政府代表機(jī)構(gòu)Csongrad縣國家食品鏈安全與動(dòng)物健康理事會(huì)根據(jù)ATET建議頒發(fā)許可（許可號：XIV./1414/2015）。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合（1）匈牙利科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科學(xué)委員會(huì)的指南，（2）歐盟關(guān)于用于科學(xué)研究的動(dòng)物保護(hù)的指令2010/63/EU，以及（3）ARRIVE指南。此外，我們聲明本研究中所有程序均在麻醉動(dòng)物身上進(jìn)行，所有動(dòng)物均被麻醉并用鎮(zhèn)痛藥治療，在整個(gè)觀察期（24小時(shí)）內(nèi)進(jìn)行生命體征的強(qiáng)化監(jiān)測，無預(yù)期或觀察到的死亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用過量戊巴比妥鈉（300 mg）對動(dòng)物實(shí)施安樂死。

新生（≤1日齡）雄性長白豬（體重：1.5-2.5 kg，n=16）從當(dāng)?shù)毓精@得，并在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天早晨送至實(shí)驗(yàn)室。通過硫噴妥鈉（45 mg/kg ip）誘導(dǎo)麻醉。仔豬通過氣管切開術(shù)插管，并通過壓力控制的小動(dòng)物呼吸機(jī)用溫暖的濕化醫(yī)用空氣（21%O?，平衡N?）進(jìn)行人工通氣，可選擇性地補(bǔ)充O?。調(diào)整呼吸設(shè)置（吸入氧濃度：0.21-0.25；呼吸頻率：30-35次/分鐘，峰值吸氣壓：120-135 mmH?O）以維持血?dú)庵岛脱躏柡投仍谏矸秶鷥?nèi)。在無菌條件下對右股靜脈進(jìn)行導(dǎo)管插入，以通過推注嗎啡（100μg/kg）和咪達(dá)唑侖（250μg/kg），然后持續(xù)輸注嗎啡（10μg/kg/h）、咪達(dá)唑侖（250μg/kg/h）和液體（5%葡萄糖，0.45%NaCl 3-5 ml/kg/h）來維持麻醉/鎮(zhèn)痛。將第二根導(dǎo)管置入右頸動(dòng)脈，用于連續(xù)監(jiān)測平均動(dòng)脈壓（MABP）和心率（HR）。

選擇該動(dòng)脈是因?yàn)榻Y(jié)扎股動(dòng)脈會(huì)在24小時(shí)復(fù)蘇期間導(dǎo)致后肢嚴(yán)重缺血（個(gè)人觀察），相反，單側(cè)頸動(dòng)脈閉塞已被證明不影響腦血流。連續(xù)測量直腸溫度，并通過伺服控制的水循環(huán)加熱冷卻墊維持在生理范圍內(nèi)（38.5±0.5°C）。使用Hewlett-Packard M1094監(jiān)測儀連續(xù)監(jiān)測氧飽和度、MABP和HR，并在線記錄。這些參數(shù)在基線、PA期間以及隨后在每個(gè)復(fù)蘇小時(shí)開始時(shí)記錄10分鐘。用血液分析系統(tǒng)分析動(dòng)脈血樣本（~300μl/樣本），在基線、窒息結(jié)束時(shí)以及之后至20小時(shí)的選擇時(shí)間點(diǎn)測定動(dòng)脈血pH、氣體張力、堿剩余、中心氧飽和度、血紅蛋白、碳酸氫鹽、葡萄糖和乳酸濃度。靜脈給予預(yù)防性抗生素：青霉素（50 mg/kg/12 h）和慶大霉素（2.5 mg/kg/12 h）。在窒息后12小時(shí)通過恥骨上穿刺引流膀胱。