摘要

本研究展示了一種新型的、基于兩步方波陽極溶出伏安法（SWASV）的針型微電極在柑橘植株中的應用，用于Zn2+的原位檢測。制備了一種雙管鉍/鉑（Bi/Pt）微電極，其具有固體金屬尖端（約110 μm），該尖端足夠堅固以穿透柑橘葉片的厚表皮，并足夠靈敏以利用SWASV檢測Zn2+濃度的ppb級變化。還確定了微電極尖端尺寸以減少傳質限制并改善檢測限（LOD）。總體而言，所開發的Bi/Pt微電極成功測量了柑橘植物維管束內的Zn2+濃度。

引言

在10年的時間里，黃龍病（HLB）已摧毀了佛羅里達州價值超過100億美元的柑橘產業。最近關于溫室潰瘍病滲透測定的研究表明了鋅螯合物的局部內吸活性；然而，對于鋅螯合物如何在柑橘樹中移動尚不清楚。盡管有許多分析方法可用于檢測水溶液中的鋅（例如，電感耦合等離子體質譜法[ICP-MS]和原子吸收光譜法[AAS]），但由于缺乏實驗工具，對鋅螯合物在柑橘樹中移動的原位監測尚未得到充分探索。迫切需要開發一種可靠的Zn2+監測工具，能夠直接在植物中追蹤其內吸活性。成功的原位Zn2+檢測將通過估計連續噴施之間韌皮部中Zn2+的時空濃度，從而更好地理解其在植物中的潛在歸宿，這將有利于評估有效管理HLB所需的噴施速率和時機。

微電極是針型電化學微電極，已用于原位監測飲用水分配系統中生物膜和腐蝕過程的目標化合物，并可通過將其尖端插入植物組織來測量細胞內自由離子活度。先前的研究已證明應用離子選擇性微電極追蹤植物中H+、K+、NO3-和Na+移動的有效性；然而，研究發現Zn2+離子選擇性電極對Cu2+存在干擾，而Cu2+是植物中常見的微量營養元素。此外，離子選擇性微電極制造困難，且當玻璃尖端接觸堅硬表面時容易破裂。微電極尖端必須為微米級以刺入韌皮部，但又必須足夠堅固以穿透植物而不破損。有報告稱，最初制備的三管電極在刺入植物后僅有9%仍能工作。

另一方面，方波陽極溶出伏安法（SWASV）幾十年來已被認為是測量痕量金屬的強大工具，并且可以消除離子選擇性電極中使用的脆弱離子選擇性膜的需求。金屬鉍（Bi）電極通過與痕量金屬形成汞齊，已被用作陽極溶出性能的工作電極。使用鉍膜的SWASV對鋅的檢測限（LOD）已達到12 ppb。SWASV因其預濃縮步驟而增強的靈敏度，使其成為測量生物基質中痕量金屬的理想工具。然而，使用三電極系統的傳統SWASV技術需要在沉積步驟中進行攪拌，這不適用于測量柑橘植物維管束內的Zn2+。此外，傳統的三電極系統需要為植物應用進行微型化。在此，我們提出使用一種新穎的兩步SWASV技術，其中預濃縮步驟使用組合的Bi/Pt微電極系統在原位單獨進行，然后轉移到溶出溶液并連接到一個更靈敏的三電極系統。在電分析中使用微電極為生物樣品中Zn2+的原位檢測提供了許多優勢，包括低背景電流、低IR降和增強的傳質速率。最后一點特性尤為重要，因為它可以減輕預濃縮步驟中對攪拌的需求，并允許在無法實現攪拌條件的植物中進行原位測量。盡管有前面描述的諸多優點，但基于SWASV的、使用微電極的Zn2+檢測尚未得到探索。

本研究首次通過探索一種用于SWASV測量Zn2+的固體型微電極，開發了一種用于柑橘植物中鋅原位檢測的新技術。引入了兩個創新概念來克服植物中Zn2+原位測量的挑戰。首先，測試了一種低熔點鉍合金（Belmont合金2451：44.7%鉍，22.6%鉛，19.1%銦，8.3%錫，5.3%鎘，熔點47°C），以此消除傳統SWASV檢測Zn2+中所需的電化學共沉積鉍。其次，評估了在陽極溶出分析前進行體內預濃縮步驟，通過僅使用雙電極系統進行預濃縮，然后轉移到更靈敏的三電極系統進行陽極溶出分析，從而最小化方法的侵入性。

方法

金屬鉍微電極的設計與制備

本研究開發了兩種不同類型的鉍（Bi）微電極，用于通過SWASV檢測Zn2+。一種是用于驗證兩步SWASV檢測Zn2+概念的單管鉍微電極，另一種是由作為工作電極的鉍（Bi）電極和作為參比電極的鉑（Pt）電極組成的雙管微電極，用于實際應用于植物樣品（附錄E）。單管微電極的制備步驟可參見其他文獻（Lee等，2011a）。簡而言之，使用Flaming/Brown型微管拉制儀（型號P-1000，Sutter Instrument Co., Novato, CA）拉制一根微量移液管（1B120-6，外徑1.2，內徑0.69，長150mm，WPI Inc. Sarasota, FL）。隨后用鑷子折斷微量移液管的尖端，并在顯微鏡下確認尖端直徑（6–85μm）。接著，將一小段（3厘米）鉍合金絲（Belmont Alloy 2451：44.7%鉍，22.6%鉛，19.1%銦，8.3%錫，5.3%鎘，熔點47°C）插入拉制好的微量移液管中，并用金屬推桿推向尖端。使用鎳鉻加熱絲（目錄號66228-066，VWR, Radnor, PA）加熱合金。一旦合金開始熔化，即用推桿施加壓力，使合金通過微量移液管的尖端。通過輕輕搖晃去除微電極尖端殘留的任何鉍合金。然后，通過熔化合金并插入一根銅線（12厘米，S4828C，26GA，Fisher Scientific, Hampton, NH），將其固定在微電極的另一端。接下來，使用微管研磨儀（BV-10，Sutter Instrument Co., Novato, CA）將微量移液管的尖端以45度角研磨，以暴露合金絲。然后用去離子水沖洗尖端，并將制作完成的微電極保存在移液管儲存盒（BX20，Sutter Instrument Co., Novato, CA）中直至使用。

由鉍工作電極和鉑參比微電極組成的雙管微電極，使用上述相同的步驟制備，但使用的是雙管微量移液管（2BF150-86-10，Sutter Instruments, Novato, CA）。將一根直徑100 μm的鉑絲（99.99%，#100-896, California Fine Wire Co., Grover Beach, CA）用銀導電環氧樹脂（8331-14G，MG chemicals, Ontario, Canada）連接到一根銅線（12厘米，S4828C，26GA，Fisher Scientific, Hampton, NH）上，并在0.1M KCN溶液中以1.2 V的電壓蝕刻25-30秒以使尖端變細。然后將鉑絲插入雙管微量移液管的一個管中，并使用微管拉制儀拉制移液管，將鉑絲密封在玻璃內。折斷第二個管的尖端，并使用單管微電極制備中描述的步驟在微電極尖端形成鉍合金。