摘要

氧化石墨烯在生物、醫(yī)療、能源和電子應(yīng)用方面顯示出巨大的潛力。由于這些應(yīng)用的多樣性，氧化石墨烯不可避免地會(huì)釋放到生態(tài)系統(tǒng)中；然而，相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)在很大程度上是未知的，尤其是在胚胎發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期。本研究發(fā)現(xiàn)，氧化石墨烯主要通過(guò)羥基相互作用附著并包裹在斑馬魚(yú)胚胎的絨毛膜上，堵塞了絨毛膜的孔道，造成明顯的缺氧和孵化延遲。此外，氧化石墨烯會(huì)自發(fā)穿透絨毛膜，通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入胚胎，破壞線粒體，并主要轉(zhuǎn)位到斑馬魚(yú)的眼睛、心臟和卵黃囊區(qū)域，這些區(qū)域涉及斑馬魚(yú)的循環(huán)系統(tǒng)。在這些器官中，氧化石墨烯誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，增加氧化應(yīng)激、DNA損傷和細(xì)胞凋亡。氧化石墨烯還會(huì)誘發(fā)眼睛發(fā)育畸形、心臟/卵黃囊水腫、尾部彎曲和心率下降。與納米粒子常見(jiàn)的劑量效應(yīng)關(guān)系不同，隨著氧化亞石墨烯濃度的增加，其對(duì)心率和尾部/脊髓彎曲的不良影響先增加后減小。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了氧化石墨烯對(duì)胚胎發(fā)育的特定不利影響，并突出了氧化石墨烯的潛在生態(tài)和健康風(fēng)險(xiǎn)。

引言

基于二維氧化石墨烯的材料因其獨(dú)特的物理化學(xué)特性，已引起各研究界和工業(yè)界的廣泛關(guān)注。有報(bào)告預(yù)測(cè)，到2020年，基于氧化石墨烯的產(chǎn)品市場(chǎng)規(guī)模將達(dá)到6.75億美元。遺憾的是，雖然基于氧化石墨烯的材料使用量的增加促進(jìn)了它們?cè)诃h(huán)境中的釋放，但與環(huán)境接觸氧化石墨烯有關(guān)的健康風(fēng)險(xiǎn)在很大程度上還不為人所知，特別是在胚胎發(fā)育方面。有關(guān)氧化石墨烯納米毒性的少量研究是在哺乳動(dòng)物、生物大分子、細(xì)菌和不同的細(xì)胞系中進(jìn)行的。使用體外細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)初步評(píng)估納米材料的毒性相當(dāng)簡(jiǎn)單，而且成本效益高；但是，要模仿體內(nèi)系統(tǒng)幾乎是不可能的，而且已經(jīng)報(bào)道了一些有爭(zhēng)議的結(jié)果。盡管小型哺乳動(dòng)物模型仍然是評(píng)估納米材料可能對(duì)人體產(chǎn)生的毒性和分布的標(biāo)準(zhǔn)方法，但建立哺乳動(dòng)物模型往往成本高昂且耗時(shí)較長(zhǎng)。因此，斑馬魚(yú)(Daniorerio)已被確立為研究納米材料體內(nèi)毒性的首選脊椎動(dòng)物模型，這是因?yàn)榘唏R魚(yú)和人類基因組之間存在密切的同源性。此外，斑馬魚(yú)和人類表現(xiàn)出相似的生理反應(yīng)，尤其是在慢性疾病的發(fā)展過(guò)程中。

胚胎發(fā)育是生命的一個(gè)重要階段，胚胎發(fā)育的功能障礙與各種疾病和不良影響有關(guān)，如缺氧、畸形、器官功能和蛻皮。斑馬魚(yú)胚胎是一種獨(dú)特的模型系統(tǒng)，可用于研究納米粒子對(duì)胚胎發(fā)生的影響；然而，迄今為止，有三個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題一直被忽視。首先，與其他納米材料相比，氧化石墨烯具有優(yōu)異的機(jī)械和親水性能，同時(shí)保持高度的柔韌性和延展性。這些特性使氧化石墨烯能夠附著在單個(gè)細(xì)胞表面。此外，最近的研究表明，氧化石墨烯可以包覆活的微生物；但是，氧化石墨烯對(duì)大型胚胎的包覆以及這一過(guò)程的不利影響仍不清楚。其次，與常見(jiàn)的納米粒子相比，盡管氧化石墨烯納米片的厚度只有大約1納米，但它的尺寸卻相當(dāng)大，長(zhǎng)度從幾十納米到幾毫米不等。因此，氧化石墨烯滲透胚胎并轉(zhuǎn)運(yùn)到特定器官的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)可能是獨(dú)一無(wú)二的。第三，與碳納米管(CNT)和富勒烯相比，二維氧化石墨烯納米片的結(jié)構(gòu)決定了其在體內(nèi)的命運(yùn)和生物相容性。氧化石墨烯的特殊包覆和轉(zhuǎn)運(yùn)特性可能會(huì)誘發(fā)獨(dú)特的納米毒性，因此應(yīng)對(duì)此進(jìn)行深入探討。

本研究的主要目的是描述氧化石墨烯納米片與斑馬魚(yú)胚胎之間的相互作用，并分析氧化石墨烯在體內(nèi)的定位和不利影響。具體來(lái)說(shuō)，我們確定了以下特性：(i)氧化石墨烯包覆發(fā)育中胚胎的絨毛膜及其在此背景下的缺氧效應(yīng)；(ii)氧化石墨烯向胚胎特定器官的轉(zhuǎn)移；(iii)活性氧(ROS)的過(guò)度生成、細(xì)胞凋亡、DNA損傷和發(fā)育畸形之間的關(guān)系。

方法

氧化石墨烯特性

目前環(huán)境中的氧化石墨烯濃度尚不清楚。為了能夠與毒性試驗(yàn)中報(bào)告的碳納米材料劑量進(jìn)行直接比較，在E3胚胎培養(yǎng)基(5mM NaCl、0.17mM KCl、0.33mM CaCl2、0.33mM MgSO4；pH7.4)中制備了不同濃度(100、10、1.0、0.1或0.01mg/L)的氧化石墨烯懸浮液。氧化石墨烯納米片(純度>99%，單層比~99%)來(lái)自南京新納米材料科技有限公司。將100.0毫克的氧化石墨烯溶解在1000毫升的E3溶液中，然后超聲1小時(shí)，就得到了100毫克/升的氧化石墨烯水溶液。使用Agilent 5420 AFM儀器在攻絲模式下采集原子力顯微鏡(AFM)圖像。在恒定的pH值(pH7.4)下，使用配備30mW 635nm激光的ZETAPALS/BI-200SM儀器對(duì)粒度分布和Zeta電位進(jìn)行表征。所有樣品的紫外可見(jiàn)光譜都是在配有UVW5軟件的T90分光光度計(jì)上，在200-800納米的1厘米路徑長(zhǎng)度石英比色皿中記錄的。傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)由布魯克Tensor27紅外光譜儀記錄，分辨率為2cm-1，波長(zhǎng)為4000-400cm-1。為了檢測(cè)組成氧化石墨烯的元素，還進(jìn)行了能量色散光譜分析。

斑馬魚(yú)和胚胎暴露于氧化石墨烯的情況在補(bǔ)充材料中有所描述。

氧化石墨烯暴露下的胚胎和缺氧微環(huán)境

為了研究氧化石墨烯對(duì)胚胎的包裹作用，使用日立SU8010顯微鏡進(jìn)行了掃描電子顯微鏡(SEM)觀察。更多詳情見(jiàn)補(bǔ)充材料。為了研究氧化石墨烯對(duì)絨毛功能群的影響，絨毛被從胚胎中分離出來(lái)并用傅立葉變換紅外光譜進(jìn)行分析。為了測(cè)量胚胎的缺氧微環(huán)境，使用Unisense氧氣微電極測(cè)量了氧氣濃度。