組織病理學分析：

將固定的空腸近端包埋在石蠟中，用顯微切片機切成5-μm的切片，然后用蘇木精和伊紅（HE）染色。在小鼠安樂死前2小時給小鼠靜脈注射5-溴-2′-脫氧尿苷，并按照之前描述的方案對空腸近端進行BrdU檢測。根據(jù)試劑盒說明書，使用CardioTACS原位細胞凋亡檢測試劑盒。

測量血漿中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、二胺氧化酶(DAO)和腸道脂肪酸結合蛋白(iFABP)的水平：

使用比色夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒檢測血漿中DAO、iFABP、TNF-α和IL-6的水平。iFABP、TNF-α和IL-6的水平用pg/ml表示，DAO的水平用U/ml表示。

丙二醛（MDA）、髓過氧化物酶（MPO）、8-羥基-2-脫氧鳥苷（8-OHdG）和超氧化物歧化酶（SOD）測定：

腸道組織中MPO、SOD和MDA的含量使用商業(yè)試劑盒進行測量；8-OHdG也使用商業(yè)試劑盒進行測量。MDA含量以pg/mg表示，8-OHdG含量以ng/mg表示。腸組織中MPO和SOD活性以U/mg表示。所有樣本均檢測三次。

測量線粒體膜電位:

將細胞加入0.5毫升JC-1工作溶液（線粒體膜電位檢測試劑盒），然后在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20分鐘。測量時，采用熒光顯微鏡觀察熒光強度，采用流式細胞術定量紅/綠熒光的比值密度。

制備細胞質總提取物和線粒體:

按照之前的描述，裂解IEC-6細胞系并制備細胞質提取物。從IEC-6細胞系中純化線粒體的方法如其他文獻所述。簡言之，將IEC-6細胞置于100μl冰冷的線粒體裂解緩沖液中培養(yǎng)，并在冰上用杵勻漿。勻漿在4°C下以1000×g離心5分鐘。然后收集上清液，在3500×g、4℃條件下離心10分鐘，得到細胞液（上清液）和線粒體（沉積物）部分。

測定培養(yǎng)的IEC-6細胞中ROS的形成情況：

用ROS熒光探針-二氫熒光素（DHE）和熒光探針2′,7′二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色，測定培養(yǎng)的IEC-6細胞中ROS的形成。測量時，使用熒光顯微鏡觀察熒光強度，使用流式細胞儀量化紅/綠熒光密度比。

Western印跡分析：

細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，并在冰上用細胞裂解緩沖液（蛋白濃度用雙喹啉酸蛋白測定法）將樣品（每道30微克）電印在聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用抗Bax抗體、抗-Bcl-2抗體、抗-Bcl-xl抗體、抗細胞色素c抗體、抗裂解的caspase-3抗體、抗裂解的caspase-9抗體、抗COX-IV抗體或抗β-肌動蛋白抗體。然后用辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗在室溫下孵育膜2小時，并用增強化學發(fā)光（ECL）試劑。

評估細胞活力和凋亡：

輻射后24小時，使用AnnexinVFITC/PI雙重染色細胞凋亡檢測試劑盒通過Annexin-V和碘化丙啶（PI）染色測定細胞凋亡。此外，我們還在DMI3000B熒光顯微鏡下用1mMPI（死細胞標記為粉紅色）和5mMHoechst33342（死細胞和活細胞標記為藍色）對雙染色細胞進行人工計數(shù)，以評估細胞存活率。此外，還使用AlamarBlue®細胞活力試測定細胞暴露于輻射后的活力。細胞活力以光密度（OD）表示，與活細胞數(shù)量成正比。

統(tǒng)計分析：

統(tǒng)計分析采用SPSS21.0Windows軟件數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。對于單項比較，我們使用非配對雙尾學生t檢驗；對于多項比較，我們使用方差分析（ANOVA）。受體存活率用Kaplan-Meier法繪制，組間差異用log-rank檢驗分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結果：

1.注射HS能明顯增加腸道組織中的氫濃度

圖1：小鼠暴露于致死劑量全身輻射（WR）后的氫濃度與體重（BW）、食物攝入量和存活率。(A)施用Hs后腸粘膜氫含量的時間變化。(B）兩組小鼠在服用致死劑量WR后15天內全部死亡。然而，氫氣明顯延遲了小鼠的死亡時間。(C）所有小鼠在WR后體重都急劇下降，而Rh組的體重總是明顯高于Rc組。(D）監(jiān)測三只小鼠全天的進食量，數(shù)據(jù)以克/3只小鼠/天表示。在服用致死劑量的WR后，食物攝入量持續(xù)減少；然而，Rh組的食物攝入量遠遠高于Rc組在相應日期的食物攝入量。

通過氫微電極測量腸組織中的氫含量。圖1A顯示，腸組織中的氫濃度在注射Hs后約5分鐘達到峰值，25分鐘后逐漸恢復到正常水平。這些結果表明，靜脈注射Hs能有效地將氫氣輸送到腸道組織中（圖1A）。

2.Hs處理可改善暴露于致命劑量WR的小鼠的腸道功能，并提高其存活率。

當小鼠接受的輻射劑量超過14Gy時，大量克隆原丟失會導致隱窩-絨毛系統(tǒng)崩潰和粘膜剝脫，最終因消化道綜合征而死亡。研究人員調查了Hs對小鼠在15GyWR劑量照射后存活的治療效果。服用Hs后，小鼠的死亡時間明顯推遲（圖1B）。

暴露于致死劑量的WR后，在最初的四天里測量了體重，這是衡量腸道功能的一個粗略指標，直到小鼠開始死亡。在這項研究中，小鼠的體重在受到輻射照射后持續(xù)下降。然而，Rh組小鼠的體重明顯高于Rc組（圖1C）。食物攝入量是對腸道功能的直接測量。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Rh組小鼠的攝食量遠高于Rc組（圖1D）。

3.Hs處理減輕了亞致死劑量WR對腸粘膜造成的損傷

圖2：氫氣可減少輻射引起的腸粘膜損傷。(A)HE染色：比較輻射后96小時的腸粘膜結構。(B)BrdU染色：輻射導致細胞增殖減少，氫氣阻止了這種變化。(C)TUNEL染色：輻射導致TUNEL陽性細胞迅速增加，氫處理阻止了這一變化。(D)在暴露于亞致死劑量WR24小時后分析血漿中iFABP和(E)DAO的水平。

Rc組小鼠出現(xiàn)明顯水腫，隱窩明顯消失，絨毛明顯縮短。然而，Hs能明顯減輕亞致死劑量WR造成的損傷（圖2A）。

4.在暴露于亞致死劑量WR的小鼠中，Hs處理可抑制細胞凋亡并維持腸上皮細胞增殖

隱窩增殖可促進細胞向上遷移，并產生終末分化的細胞填充絨毛，從而使腸粘膜從輻射引起的損傷中恢復過來。BrdU染色顯示，在暴露于亞致死劑量WR 24小時后，隱窩開始增殖。與S組相比，Rc組增殖的隱窩數(shù)量顯著減少。然而，Rh組小鼠的增殖隱窩數(shù)量高于Rc組（圖2B）。

小腸隱窩上皮細胞是最易受輻射誘導凋亡影響的細胞之一。末端脫氧核苷酸轉移酶dUTP鎳末端標記（TUNEL）染色法用于比較暴露于亞致死劑量WR24小時后的細胞凋亡情況。在輻照小鼠中觀察到TUNEL陽性細胞急劇增加，而在Rh組中TUNEL陽性細胞較少（圖2C）。

5.Hs處理可降低暴露于亞致死劑量WR的小鼠血漿中DAO和iFABP的水平

iFABP和DAO是腸粘膜損傷的兩種敏感而特異的標記物，只存在于腸粘膜細胞內。一旦腸粘膜受到損傷，這些標記物就會釋放到血液中。圖2D和2E顯示，在亞致死劑量WR作用24小時后，Hs處理顯著降低了iFABP和DAO的水平。

6.Hs處理可緩解暴露于亞致死劑量WR的小鼠的氧化應激損傷和全身炎癥反應

圖3.氫氣降低了小鼠的氧化應激和全身炎癥反應。(A)SOD、(B)MDA、(C)8-OHdG、(D)TNF-α、(E)IL-6和(F)MPO在接觸亞致死劑量WR24小時后進行分析。

SOD是一類內源性抗氧化劑，它通過自身被氧化來抑制或延緩氧化過程，這對減少氧化應激損傷非常重要。圖3A顯示，在亞致死劑量WR作用24小時后，Rh組的SOD活性高于Rc組。

MDA是氧化應激引起脂質過氧化的標志。輻射會導致MDA含量明顯增加，而氫處理會明顯降低MDA濃度，這表明氫保護了脂質免受過氧化（圖3B）。

此外，我們目前的研究表明，輻照會導致8-OHdG的積累，而8-OHdG是-OH引起DNA氧化的主要產物之一。氫處理減少了8-OHdG的積累，表明氫能保護核DNA免受氧化（圖3C）。

輻射是一種多因素的病理損傷，會導致炎癥分子激增。在本研究中，我們重點研究了兩種關鍵的炎癥分子：TNF-α和IL-6。氫氣處理明顯降低了亞致死劑量WR24小時后血漿中TNF-α和IL-6的水平（圖3D和3E）。

MPO占中性粒細胞干重的5%。因此，MPO活性可用于估計組織中的中性粒細胞數(shù)量。圖3F顯示，在施用亞致死劑量的WR24小時后，氫處理顯著降低了腸組織中的MPO活性。

7.Hm可抑制6Gy輻射后IEC-6細胞中ROS的形成

圖4：氫氣抑制6Gy輻射后30分鐘IEC-6細胞中ROS的形成。(A)用DCFH-DA（綠色）和Hoechst33342（藍色）共同染色IEC-6細胞，然后用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。綠色熒光的強度與ROS的數(shù)量呈正相關。(B)用流式細胞儀量化的ROS水平分布代表圖。根據(jù)流式細胞儀的結果得出ROS水平的直方圖。(C)用DHE（紅色）和Hoechst33342（藍色）共同染色IEC-6細胞。紅色熒光的強度與ROS的數(shù)量呈正相關，Hoechst33342染色用于量化細胞數(shù)量。

為了確定氫作為自由基清除劑的能力，我們通過兩種熒光探針比較了IEC-6細胞受到輻射后ROS的形成：DCFH-DA和DHE。一旦細胞用DCFH-DA染色，ROS形成的細胞表現(xiàn)出綠色熒光。在我們的研究中，用氫處理的細胞顯示出較低水平的綠色熒光密度（圖4A）。此外，我們還通過流式細胞術對ROS水平進行了量化。我們的數(shù)據(jù)顯示，氫處理明顯抑制了ROS形成的瞬時增加（圖4B）。

此外，IEC-6細胞還標記了另一種ROS熒光探針DHE探針。通過紅色熒光強度評估ROS的形成。結果表明，氫處理能明顯降低輻射誘導的紅色熒光強度（圖4C）。