2.4. 沉積物和水樣分析


通過稱量沉積物樣品在60°C烘干24小時前后的重量測定其含水率。所有水樣均經0.2微米濾膜過濾，并于4°C儲存直至分析。用于微生物群落分析的沉積物樣品在第60天和第90天采集，并于-20°C儲存。沉積物和地下水樣品中的金屬元素經酸消解后使用原子吸收光譜法進行分析。使用pH計測量pH。使用分光光度法測定硫酸鹽、硝酸鹽和COD。使用帶保護陰極的克拉克型氧微電極測量DO。采用1小時HCl提取后接菲洛嗪分析法測定生物可利用的Fe(III)。使用ICP-MS分析水體總溶解鈾，鈾的檢測限為0.001毫克/升。


沉積物樣品的含水量通過稱重測定，分別在60℃干燥24小時前后進行。所有水樣均通過0.2毫米濾膜過濾，并在4℃保存直至分析。用于微生物群落分析的沉積物樣品分別于第60天和第90天采集，并保存于20℃。沉積物和地下水樣品中的金屬元素采用酸消化（HF/高氯酸/硝酸）后進行原子吸收光譜分析（PerkinElmer，PinAAcle 900E，USA）。硫酸鹽、硝酸鹽和COD采用分光光度法測定（T6系列紫外可見分光光度計，Purkinje General，China）（SEPA ，2002）。pH值使用pH微電極（Unisense AS，Aarhus，Denmark）測定。溶解氧使用帶保護陰極的Clarke型氧微電極（Unisense AS，Aarhus，Denmark）測定。生物可利用Fe(III)通過1小時鹽酸提取后進行ferrozine分析進行定量。水體總溶解鈾采用 ICPMS（Agilent，7700 X，USA）分析，其鈾檢測限為0.001 mg/L。


2.5. U(VI)和U(IV)的化學萃取


為測定不同時間點吸附態U(VI)和生物成因U(IV)的比例，首先將約0.5克沉積物樣品在5毫升100 mM碳酸氫鈉溶液中厭氧提取48小時，然后將沉積物-碳酸氫鹽漿液置于空氣中24小時以使U(IV)氧化為U(VI)。通過這種方式，可以測定沉積物中的總鈾、吸附態U(VI)和生物成因U(IV)。


2.6. U L3邊XANES測量


熒光U L3邊XAFS測量在中國上海同步輻射裝置BL14W1光束線進行。所有光譜均在室溫下以熒光模式收集。熒光X射線均使用填充有N?和He氣體1:1混合物的電離室監測。該站使用Si(111)雙晶單色器來選擇能量。測量期間，同步輻射裝置運行能量為3.5 GeV。通過同時測量硝酸鈾酰光譜，并將其第一拐點定義為17,166 eV，來校準光子能量。沉積物中鈾的平均價態可以通過比較其吸收邊能量與標準U(VI)和U(IV)的吸收邊能量來估算。這種比較稱為X射線吸收近邊結構分析，使用ATHENA-IFEFFIT軟件進行。


2.7. DNA提取、PCR擴增和454鈦焦磷酸測序


分別在第60天和第90天從每個添加了電子供體的罐中采集約1克沉積物樣品。使用E.Z.N.A.土壤DNA試劑盒提取儲存在-20°C的樣品以及培養的沉積物樣品的群落核酸。使用引物341F和1073R從提取的DNA中擴增16S rRNA基因片段，每個樣品使用一個獨特的6堿基標簽或條形碼。每個PCR反應在50 μL反應混合物中進行，包含20 ng DNA、200 μM dNTP、各0.4 μM的引物、1× Pyrobest緩沖液和1.25單位的Pyrobest DNA聚合酶。PCR在ABI GeneAmp®9700上進行，條件如下：94°C 5分鐘；94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 30秒，共25個循環；最后72°C延伸7分鐘。20 μL PCR混合物包含0.4 μL Fastpfu DNA聚合酶、4 μL 5× FastPfu緩沖液、2 μL dNTPs、各5 μM的引物和10 ng基因組DNA。熱循環步驟如下：95°C 2分鐘；然后95°C 30秒、55°C 30秒、72°C 30秒，共25個循環；最后72°C延伸5分鐘。


表1：實驗期間微觀體系縮寫定義
縮寫 縮寫定義
E-D 第60天從乙醇添加微觀體系采集的沉積物樣品。
E-A 第90天從乙醇添加微觀體系采集的沉積物樣品。
L-D 第60天從乳酸添加微觀體系采集的沉積物樣品。
L-A 第90天從乳酸添加微觀體系采集的沉積物樣品。
G-D 第60天從葡萄糖添加微觀體系采集的沉積物樣品。
G-A 第90天從葡萄糖添加微觀體系采集的沉積物樣品。
C-A 第90天從未添加電子供體的對照微觀體系采集的沉積物樣品。
S-B 培養前的原始沉積物樣品。

通過瓊脂糖凝膠電泳純化PCR擴增產物，然后使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒回收PCR產物。使用配備PicoGreen® dsDNA定量試劑的QuantiFluor?-ST系統評估PCR擴增產物的濃度和純度。根據標準方案，在454/Roche GS-FLX Titanium儀器上進行測序反應。在焦磷酸測序中，使用C-A、S-B、E-D、E-A、G-D、G-A、L-D和L-A來代表實驗期間來自微觀體系的不同沉積物樣品。


2.8. 序列分析和分類學分類


使用Seqcln和mothur處理從7個樣品獲得的序列。去除低質量序列、短于200 bp的序列、含有超過六個核苷酸同聚物的序列以及含有模糊堿基識別或錯誤引物序列的序列后，總共獲得74031條高質量序列，平均每條序列長度為513 bp。為了比較樣品的多樣性和操作分類單元豐度，將每個樣品的序列隨機二次采樣至6000條，形成每個樣品的歸一化文庫。使用UPARSE流程對歸一化的讀長進行聚類，相似度超過97%的序列被認為屬于同一個OTU。隨后，使用UCHIME檢測并去除嵌合序列。使用mothur在97%相似性水平上，從歸一化文庫中確定每個樣品的群落豐富度和多樣性指數，如香農指數和Ace指數。使用RDP分類器在70%置信閾值下對每個OTU的代表性序列進行系統發育分類。