2. 實驗部分

2.1. 儀器

采用配備532 nm激光波長的B&W Tek 532光纖型便攜式拉曼光譜儀記錄SERS光譜。使用X-Y-Z載物臺固定光學探頭，便于激光聚焦到SERS基底。儀器具體參數設置如下：100 mW激光功率，1000 s積分時間，100次掃描頻率。正式測量前，分別對532 nm激光光纖便攜式拉曼分析儀進行了峰值校準和波長校準。

使用Ocean Optics USB2000光譜儀測量Ag膠體的等離子體特征。使用日本日立有限公司型號為Regulus8100的高分辨率掃描電子顯微鏡表征SERS基底的形貌。pH微電極（外尖端直徑50 μm）和玻璃參比微電極（外尖端直徑：~20 μm，填充150 mM NaCl，電阻：~4-5x1010歐姆）購自Unisense（優(yōu)尼森，丹麥）。使用顯微操作平臺（CASCADE, MH2-B）固定微電極，進行組織插入的顯微操作。使用購自杭州尚強智能技術有限公司的等離子體電暈機（ZLD-06）清潔玻璃載玻片表面。

2.2. SERS基底制備

圖1(A)顯示了制備SERS基底的步驟。首先，將玻璃載玻片切割成1 cm x 1 cm的正方形。然后，將載玻片依次浸入無水乙醇、丙酮和水中各超聲清洗5分鐘。之后，用氮氣吹干。接下來，用等離子體電暈機處理玻璃載玻片2分鐘，使其表面羥基化。然后，將其浸入聚二烯丙基二甲基氯化銨（PDDA, 0.25 mol/L）中30分鐘，使玻璃載玻片表面帶正電荷。用純水清洗三次以去除多余的PDDA后，將其浸入新鮮制備的銀納米粒子膠體中過夜。由于AgNPs帶負電，玻璃載玻片表面會通過靜電相互作用吸附AgNPs。用純水清洗三次后，將AgNP組裝膜浸入4-MPY乙醇溶液（0.1 mol/L）中1分鐘，通過Ag-S鍵形成使報告分子飽和吸附。因此，AgNPs表面上幾乎沒有留給其他生物分子的位點。盡管某些生物分子含有巰基并傾向于附著在Ag上，但由于它們濃度相對較低且配體交換時間短（10 s），它們幾乎沒有機會從Ag表面取代4-MPY分子。然后，將組裝膜浸入AgNP膠體中，并在恒溫（4°C）下保存，以避免SERS基底中的納米顆粒嚴重表面氧化。當使用AgNPs組裝芯片進行SERS測量時，用純氮氣吹干以避免空氣氧化。

圖1。A)用于SERS測量的pH響應型SERS傳感芯片制備。B)所制備銀納米顆粒的紫外光譜。C)玻璃載片上方銀納米顆粒組裝膜的掃描電鏡圖像。D)銀納米顆粒組裝膜增強的4- MPY 的SERS光譜。

2.3. SERS基底的pH響應特性

評估SERS基底的pH響應特性。將pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0和7.5的不同pH緩沖液分別滴在上述制備的基底上。干燥后，對每種pH條件隨機采集8個點的SERS光譜。每次試驗的積分時間和激光功率保持恒定。對獲得的原始光譜進行基線和偏移處理。對每種pH條件下獲得的八個光譜數據求平均值，最終得到4-MPY在五種不同pH緩沖液下的SERS光譜。計算1091 cm-1與1580 cm-1的峰強度比，并使用Origin 8.5軟件繪制比值與pH值的關系圖。

2.4. 裸鼠荷瘤模型制備

如圖2所示，體外培養(yǎng)人源性膠質瘤細胞U87細胞。當細胞密度達到1 x 107時，進行消化并以1000 rpm離心，棄去上清液。用細胞培養(yǎng)基將細胞懸液稀釋至2.0 mL。通過細胞懸液植入法將U87膠質瘤細胞懸液注射到胸腺切除小鼠的上肢腋下。培養(yǎng)14天后，獲得約1.0 cm3的膠質瘤。在局部麻醉下，將小鼠異位膠質瘤細胞完全剝離。所有動物均飼養(yǎng)在無病原體環(huán)境中，自由進食。動物護理和使用程序經吉林大學中日聯誼醫(yī)院倫理委員會批準，并遵循所有關于動物倫理使用的適用機構和政府規(guī)定。

圖2. 裸鼠荷瘤模型的制備、膠質瘤樣本間質液的提取及其便攜式光纖拉曼光譜儀的表面增強拉曼散射（SERS）測量。

為了收集小鼠膠質瘤細胞微環(huán)境的局部pH值，將4.0 μL水滴置于小鼠膠質瘤細胞表面，讓組織間液擴散到水滴中。10秒后，用移液器重新吸取，然后滴在SERS基底上。10分鐘后，用便攜式拉曼光譜儀記錄水滴的拉曼光譜。我們調整x-y-z載物臺以實現光學鏡頭聚焦，以獲得最高的SERS信號。收集小鼠膠質瘤的四個不同位置，并在每個位置測量10個SERS光譜。對獲得的原始光譜進行基線和偏移處理，然后按上述方法求平均值。

2.5. 微電極法測量小鼠膠質瘤組織間液pH

采用微電極技術測量小鼠膠質瘤組織局部組織間液的pH值。實驗前，用四種不同的pH緩沖溶液（6.20、6.55、6.80和7.25）校準微電極。通過Sensor Trace Suite-Logger軟件獲得微電極標準曲線。正式測量前，我們將標準測量電極和參比電極固定在微操作平臺上。我們將標準pH微電極的尖端插入腫瘤組織以尋找組織間隙，并將參比電極固定在腫瘤組織表面。為了證明其重現性，我們測量了4個點，并獲得了4個電位差。根據上述標準曲線將電位數據轉換為pH值。