摘要

膠質(zhì)瘤是全球最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤之一。由于膠質(zhì)瘤具有侵襲性且與正常腦組織缺乏清晰邊界，神經(jīng)外科醫(yī)生只能根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷手術(shù)切除范圍。因此，精確劃定其邊界已成為外科醫(yī)生面臨的一大挑戰(zhàn)。由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的高糖酵解代謝，細(xì)胞外液酸化已成為膠質(zhì)瘤進(jìn)展的一個(gè)指標(biāo)。本文開發(fā)了一種比值pH響應(yīng)表面增強(qiáng)拉曼散射策略，用于快速識(shí)別膠質(zhì)瘤邊界。制備了由銀納米粒子自組裝薄膜組成的傳感芯片，然后自組裝了pH響應(yīng)SERS報(bào)告分子4-巰基吡啶。在不同pH條件下，4-MPY的特征SERS峰比值有規(guī)律地變化。通過測(cè)量組織間液浸潤(rùn)水滴的pH值來確定膠質(zhì)瘤侵襲的邊界。該技術(shù)能夠準(zhǔn)確、無創(chuàng)、快速地測(cè)定局部pH值，從而在最大限度切除腫瘤組織的同時(shí)，最小化對(duì)正常組織的損傷。與術(shù)中病理檢測(cè)相比，該技術(shù)更快速、簡(jiǎn)單，有望用于術(shù)中導(dǎo)航。

1. 引言

膠質(zhì)瘤是全世界最常見的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在過去幾十年中，老年人群膠質(zhì)瘤的發(fā)病率逐年上升。目前，手術(shù)切除仍然是惡性腫瘤治療的主要方式。特別是對(duì)于膠質(zhì)瘤，提高生存患者的生活質(zhì)量和最小化術(shù)后并發(fā)癥具有重要意義。過于保守的切除會(huì)導(dǎo)致微小殘留病變，導(dǎo)致腫瘤快速?gòu)?fù)發(fā)；而切除過于激進(jìn)可能會(huì)破壞腫瘤周圍的重要功能區(qū)，導(dǎo)致失語(yǔ)、癱瘓等嚴(yán)重后遺癥。然而，由于惡性腫瘤的侵襲性，識(shí)別其邊界尤為困難。磁共振成像是目前臨床確定膠質(zhì)瘤邊界的方法。該技術(shù)需要患者較高的配合度，并且即使在健康人腦中功能和結(jié)構(gòu)也存在差異。個(gè)體間的差異、腦腫瘤的影響及其相關(guān)的占位效應(yīng)可能會(huì)扭曲常見的解剖標(biāo)志，導(dǎo)致解剖功能定位不準(zhǔn)確。目前，外科醫(yī)生通常會(huì)選擇最后一塊要切除的邊緣組織進(jìn)行病理檢查。然而，病理檢查通常耗時(shí)較長(zhǎng)，間接延長(zhǎng)了手術(shù)時(shí)間，大大增加了深度麻醉患者的風(fēng)險(xiǎn)。因此，開發(fā)一種快速、簡(jiǎn)單、高效的膠質(zhì)瘤術(shù)中診斷方法迫在眉睫。

與正常組織相比，腫瘤的代謝傾向于從氧化磷酸化轉(zhuǎn)向無氧糖酵解，以滿足快速增殖的惡性腫瘤細(xì)胞的需求，這導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在局部微環(huán)境中產(chǎn)生大量乳酸。這已成為惡性腫瘤最明顯的特征之一。腫瘤細(xì)胞創(chuàng)造的微酸性環(huán)境有助于建立免疫逃逸環(huán)境，從而促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)。因此，已開發(fā)了用于識(shí)別組織酸性微環(huán)境的檢測(cè)和診斷方法來指示惡性程度。Vo-Dinh 和 Tuan 使用光纖納米探針結(jié)合共聚焦顯微鏡檢測(cè)前列腺癌和乳腺癌組織的酸性微環(huán)境，從而準(zhǔn)確區(qū)分腫瘤組織和正常組織之間的差異。Rochefort小組用微電極測(cè)量了MCF7乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞外pH，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞比正常乳腺細(xì)胞具有更強(qiáng)的酸化細(xì)胞外環(huán)境的能力。這些結(jié)果證實(shí)，酸性環(huán)境是腫瘤組織和癌細(xì)胞的重要特征之一。

表面增強(qiáng)拉曼散射是一種在表面和界面上產(chǎn)生的異常光學(xué)效應(yīng)。當(dāng)分子吸附在粗糙金屬表面上時(shí)，其拉曼信號(hào)可增強(qiáng)10^14倍。SERS光譜具有極高的檢測(cè)靈敏度，可達(dá)到單分子檢測(cè)水平。此外，SERS檢測(cè)技術(shù)還具有無損檢測(cè)、快速檢測(cè)和原位測(cè)量等諸多優(yōu)點(diǎn)。SERS光譜的特征峰窄，可以提供豐富的分子指紋信息。因此，這種光譜技術(shù)特別適用于生物系統(tǒng)和細(xì)胞相關(guān)的檢測(cè)系統(tǒng)。近年來，利用SERS檢測(cè)腫瘤微環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)外微環(huán)境一直是一個(gè)熱門話題。作為腫瘤微環(huán)境的重要參數(shù)之一，細(xì)胞pH的SERS檢測(cè)受到了極大關(guān)注。這些方法基于多種SERS報(bào)告分子，這些分子已被連接到貴金屬納米粒子表面以制備pH響應(yīng)SERS納米傳感器。常用的pH SERS報(bào)告分子包括4-巰基吡啶、對(duì)巰基苯胺、3-氨基-5-巰基-1,2,4-三唑和2-巰基苯胺等。這些SERS報(bào)告分子通過其峰強(qiáng)度或相對(duì)強(qiáng)度的變化來響應(yīng)pH。先前的研究報(bào)道，通過在腫瘤組織表面分散pH響應(yīng)的、基于金納米顆粒的納米傳感器，通過SERS策略識(shí)別腫瘤邊界。然而，由于這些納米傳感器分布不均勻，SERS峰強(qiáng)度會(huì)受到很大影響，從而顯著影響檢測(cè)準(zhǔn)確性。

在本研究中，制備了一種固體支撐的pH響應(yīng)SERS基底，并開發(fā)了相應(yīng)的快速診斷膠質(zhì)瘤邊界的策略，以根據(jù)腫瘤的微酸性微環(huán)境識(shí)別腫瘤邊界。該SERS基底通過層層組裝法制備，其中一層自組裝的新鮮制備銀納米粒子單層被聚電解質(zhì)橋接，然后是自組裝的4-MPY拉曼報(bào)告分子層。4-MPY的兩個(gè)SERS峰的比值變化（I1091/I1580）可以識(shí)別pH。在腫瘤組織表面構(gòu)建純水水滴陣列，使組織間液擴(kuò)散到水滴中。然后，將水滴轉(zhuǎn)移到SERS基底上，并用便攜式拉曼光譜儀測(cè)量SERS光譜。由于腫瘤區(qū)域的酸化特性，我們可以檢測(cè)腫瘤組織與正常組織之間的不同pH值，從而準(zhǔn)確區(qū)分腫瘤組織與正常組織的邊界。我們還采用了pH微電極和電化學(xué)系統(tǒng)來驗(yàn)證SERS結(jié)果。該傳感器芯片制備簡(jiǎn)單可控，檢測(cè)效果穩(wěn)定。可實(shí)現(xiàn)快速診斷。儀器便攜緊湊，操作簡(jiǎn)便。該方法對(duì)手術(shù)組織無害，有望替代膠質(zhì)瘤的快速病理檢測(cè)，成為一種可行的術(shù)中導(dǎo)航技術(shù)。