使用SWASV進(jìn)行微電極性能評(píng)估

為了將開發(fā)的雙管微電極應(yīng)用于植物系統(tǒng)，對(duì)傳統(tǒng)SWASV進(jìn)行了修改，采用原位沉積和異位陽極溶出的兩步法（圖7-1）。首先，在含有不同濃度ZnCl2（0–300 ppm Zn2+）的Tris緩沖液（pH范圍5.0至7.5）中，將Zn2+沉積在鉍微電極上，以模擬植物環(huán)境。使用雙電極系統(tǒng)，在攪拌和不攪拌兩種條件下，對(duì)鉍微電極施加相對(duì)于鉑參比電極為-1.4V的沉積電位，持續(xù)180秒。然后將微電極取出，用去離子水沖洗，并轉(zhuǎn)移到溶出溶液（不攪拌）中，在此使用恒電位儀（Palmsens3, Palmsens BV, Netherlands）進(jìn)行SWASV掃描（掃描：-1.4V 至 -0.4V；步進(jìn)：10mV；振幅：40mV；頻率：5 Hz）以確定Zn2+濃度。在方波掃描期間，使用鉑網(wǎng)作為對(duì)電極，并使用Ag/AgCl電極（MI-401, Microelectrode Inc., Bedford, NH）作為參比電極。掃描后，通過在相同溶液中施加-0.4V電壓30秒來清潔微電極。

圖7-1. 在柑橘植物維管束中兩步SWASV測(cè)定Zn2+的概念圖。

在柑橘葉片中的原位應(yīng)用

在將開發(fā)的Bi/Pt微電極應(yīng)用于柑橘葉片之前，從酸橙幼苗上采集樣品葉，通過將葉柄浸入1 mM ZnCl2溶液中6小時(shí)來引入Zn2+。對(duì)照樣品暴露于去離子水中6小時(shí)。然后用去離子水沖洗所有葉片的表面，并用Kimwipe擦拭干。使用自動(dòng)三維（3D）微操作器（UNISENSE A/S, 丹麥）將組合式Bi/Pt微電極的尖端定位在中脈表面下400 μm處，用于Zn2+的原位沉積。pH微剖面和橫截面圖像的初步結(jié)果（附錄E）表明，大約300–400μm是柑橘幼苗韌皮部的典型深度。使用pH微電極（尖端直徑10 μm，UNISENSE A/S, 丹麥）和3D微操作器（UNISENSE A/S, 丹麥）進(jìn)行了局部原位pH測(cè)量。在Bi/Pt微電極的Bi側(cè)沉積Zn2+后，取出微電極，用去離子水沖洗，并使用自動(dòng)3D操作器將其轉(zhuǎn)移到陽極溶出溶液（0.1M醋酸緩沖液，pH 4.5）中。在移動(dòng)步驟中，使用帶CCD相機(jī)的立體顯微鏡（World Precision Instruments, Sarasota, FL）監(jiān)測(cè)微電極尖端的位置。使用恒電位儀（Palmsens3, Palmsens BV, Netherlands）進(jìn)行SWASV掃描，參數(shù)與校準(zhǔn)時(shí)使用的相同。所有實(shí)驗(yàn)均在法拉第籠（81-334-04, Technical Manufacturing Co., Peabody, MA）中進(jìn)行，以避免電干擾。為確保電極性能，進(jìn)行了使用前和使用后的校準(zhǔn)。

結(jié)果與討論

使用兩步SWASV進(jìn)行Zn2+檢測(cè)

陽極溶出分析的顯著靈敏度源于高效的預(yù)濃縮步驟與對(duì)累積金屬進(jìn)行靈敏的伏安溶出測(cè)量的結(jié)合。對(duì)于傳統(tǒng)的SWASV測(cè)量，預(yù)濃縮和溶出步驟發(fā)生在同一溶液中；然而，這不適用于柑橘樹的原位檢測(cè)。為了最小化在柑橘植物維管束內(nèi)進(jìn)行連續(xù)SWASV測(cè)量的影響，預(yù)濃縮步驟需要先使用一個(gè)組合的雙電極系統(tǒng)在原位單獨(dú)進(jìn)行，然后轉(zhuǎn)移到溶出溶液并連接到一個(gè)更靈敏的三電極系統(tǒng)。這一兩步過程使用鉍微電極進(jìn)行了評(píng)估，并與傳統(tǒng)的SWASV測(cè)量進(jìn)行了比較。對(duì)于常規(guī)測(cè)量，沉積步驟和溶出步驟均在pH 4.5的乙酸緩沖溶液（0.1 M）中進(jìn)行，使用鉑網(wǎng)對(duì)電極和Ag/AgCl參比電極。對(duì)于本研究中使用的改進(jìn)的兩步測(cè)量，沉積是在模擬植物系統(tǒng)的單獨(dú)Zn2+溶液（Tris緩沖液+ZnCl2）中進(jìn)行的，然后轉(zhuǎn)移到pH 4.5的乙酸緩沖液中進(jìn)行溶出。

圖7-2顯示了兩種方法之間響應(yīng)的差異。對(duì)于常規(guī)的SWASV測(cè)量，在200 ppm Zn2+濃度下觀察到的Zn2+峰高為0.022 μA。這顯著大于使用相同鉍微電極的兩步SWASV方法所得到的0.009 μA峰高。然而，研究發(fā)現(xiàn)兩種方法在1至200 ppm Zn2+濃度范圍內(nèi)都能表現(xiàn)出線性響應(yīng)。雖然常規(guī)SWASV測(cè)量對(duì)Zn2+顯示出更高的靈敏度（101 pA/ppm 對(duì)比 38 pA/ppm），但兩步法也能以優(yōu)異的線性響應(yīng)（R2=0.990）測(cè)量相關(guān)的Zn2+濃度。該結(jié)果首次表明兩步SWASV方法可以在植物系統(tǒng)中工作。

圖7-2. 開發(fā)的鉍微電極（尖端尺寸：直徑6 μm）對(duì)各種Zn2+濃度（1–200 ppm）的SWASV響應(yīng)對(duì)比：（a）常規(guī)方法：在pH 4.5乙酸緩沖液中沉積（攪拌）和溶出（不攪拌）；（b）兩步SWASV方法：在ZnCl2溶液中沉積（不攪拌）并在pH 4.5乙酸緩沖液中溶出（不攪拌），溫度為23°C。插圖：1-100 ppm Zn2+的校準(zhǔn)曲線。

植物pH對(duì)微電極響應(yīng)的影響

使用兩步SWASV方法，在固定濃度為200 ppm Zn2+的去離子水溶液中，在pH 5.0至7.5的范圍內(nèi)研究了植物pH的影響（圖7-3）。使用HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH。該pH范圍是柑橘植物維管束的典型范圍（Hijaz和Killiny 2014），本研究中也使用pH微電極進(jìn)行了測(cè)定（附錄E）。在最低pH（5.0）時(shí)獲得了最大的響應(yīng)，為1.78 μA；然而，pH 5到6.5之間的響應(yīng)是可比的，范圍在1.40到1.78 μA之間。在pH 7.0時(shí)，對(duì)Zn2+的響應(yīng)顯著下降了63%，峰值為0.66 μA，而pH 7.5時(shí)的響應(yīng)小于pH 5.0時(shí)電極信號(hào)的1%。這種隨著pH升高響應(yīng)下降的現(xiàn)象與Zn2+形態(tài)隨水溶液pH變化的情況一致。使用水化學(xué)模擬軟件（MINEQL）證實(shí)，當(dāng)pH升高超過7.2時(shí)，Zn2+的溶解度會(huì)降低。因此，開發(fā)的SWASV微電極很可能是在整個(gè)測(cè)試pH范圍內(nèi)對(duì)可溶性Zn2+濃度產(chǎn)生響應(yīng)，并且當(dāng)pH升高到7.5時(shí)，僅有少量可溶性Zn2+可供檢測(cè)。考慮到維管束的pH預(yù)計(jì)低于7，大部分鋅很可能通過使用鉍/鉑微電極開發(fā)的兩步SWASV方法檢測(cè)到。

圖7-3. 預(yù)濃縮過程中pH對(duì)Zn2+濃度的SWASV響應(yīng)的影響（插圖：鉍微電極在不同預(yù)濃縮pH值下的SWASV伏安圖）。

尖端尺寸和傳質(zhì)對(duì)SWASV響應(yīng)的影響

SWASV對(duì)Zn2+濃度的響應(yīng)部分與工作電極的表面積有關(guān)。因此，研究了微電極尖端尺寸的影響，以優(yōu)化開發(fā)的鉍微電極用于柑橘植物的應(yīng)用。理想的尖端尺寸應(yīng)足夠小以穿透韌皮部，但又足夠大以對(duì)不同Zn2+濃度產(chǎn)生可區(qū)分的SWASV響應(yīng)。圖7-4(a)顯示了開發(fā)的鉍微電極在不同尖端尺寸（從10到85 μm）下的校準(zhǔn)曲線（附錄E）。正如預(yù)期，較大的尖端尺寸增加了SWASV響應(yīng)的靈敏度。例如，85 μm尖端尺寸的斜率為0.154 μA/ppm Zn2+，而10 μm尖端尺寸的斜率僅為0.0012 μA/ppm Zn2+。這些電極在單位表面積上表現(xiàn)出相似的靈敏度，平均歸一化靈敏度為每平方厘米1,246 ± 285 μA/ppm Zn2+。在攪拌條件下，85 μm尖端的LOD低于0.65 ppm Zn2+，而較小的尖端尺寸（例如，10 μm）具有較高的LOD（例如，~11 ppm Zn2+）。在攪拌條件下，微電極的凹陷對(duì)電極響應(yīng)沒有顯著影響（表7-1）。

圖7-4. 傳質(zhì)對(duì)Zn2+檢測(cè)的影響：在沉積步驟中，不同尖端尺寸的鉍微電極在（a）攪拌和（b）不攪拌條件下的Zn2+ SWASV校準(zhǔn)曲線。插圖：電極在0到50 ppm Zn2+濃度范圍內(nèi)的響應(yīng)放大視圖。