BNC管的生產(chǎn)

BNC管的生產(chǎn)在Bodin等人13和Hong等人16設(shè)計(jì)的兩種生物反應(yīng)器中進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，第一個(gè)由Bodin等人描述的（縮寫為S-BNC生物反應(yīng)器）通過(guò)將一根長(zhǎng)硅膠管（外徑x壁厚：3x0.5 mm，長(zhǎng)度14 cm）固定在玻璃管（直徑9x0.5 mm，長(zhǎng)度13 cm）中心來(lái)組裝，用于制備S-BNC管，如圖1（A）所示。硅膠管和玻璃管之間長(zhǎng)度為12 cm的空腔完全充滿約5 mL預(yù)培養(yǎng)物，長(zhǎng)硅膠管的內(nèi)腔連接一個(gè)空氣入口。第二個(gè)由Hong等人描述的（縮寫為D-BNC生物反應(yīng)器）用于生產(chǎn)D-BNC管。D-BNC生物反應(yīng)器由兩根硅膠管（直徑分別為3x0.5 mm和9x0.5 mm）組成，其中較細(xì)的管固定在較粗管的中心，如圖1（B）所示。將兩個(gè)生物反應(yīng)器靜態(tài)放置在充滿氧氣（10 Pa）的容器中，在30°C下培養(yǎng)14天。

BNC管的純化

收獲的BNC管用超純水沖洗以去除可溶性成分，然后在80°C的1.0%（w/v）氫氧化鈉水溶液中孵育4小時(shí)以消除細(xì)菌細(xì)胞。之后，BNC管進(jìn)一步用超純水洗滌以去除其他雜質(zhì)，直至洗滌水的pH值為中性。然后將BNC管保存在4°C的超純水中。

溶解氧檢測(cè)

使用氧傳感器（Unisense OX-13896，丹麥）檢測(cè)溶解氧（DO）。簡(jiǎn)而言之，將校準(zhǔn)后的傳感器針尖浸入培養(yǎng)基中檢測(cè)初始DO 1分鐘，數(shù)據(jù)采集頻率為每分鐘120個(gè)數(shù)據(jù)。類似地，在培養(yǎng)第4天，將傳感器尖端插入生物反應(yīng)器沿口徑方向的三個(gè)位置（IP：靠近內(nèi)部硅膠管的位置，OP：靠近外部硅膠管或玻璃管的位置，以及MP：內(nèi)外管之間的中間位置）以檢測(cè)氧濃度。選擇三個(gè)等效位置給出平均值。為了測(cè)量培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液的DO變化，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，并在培養(yǎng)液快速擠出后立即進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)行三次平行測(cè)量。

細(xì)菌細(xì)胞分布表征

培養(yǎng)4天后，將BNC管從生物反應(yīng)器中取出，并小心浸入組織最佳切割溫度（OCT）冷凍培養(yǎng)基（SAKURA Tissue-Tek®,USA）中20分鐘。使用冷凍切片機(jī)E儀器（Thermo Scientific,USA）制備厚度為50μm的切片標(biāo)本。然后將標(biāo)本轉(zhuǎn)移到孔徑為0.22μm的Nuclepore Track-Etch膜（Whatman®,Britain）上。用生理鹽水抽濾洗滌后，將標(biāo)本在染色溶液（SYTO 9綠色熒光核酸染料，15μmol L-1溶于PBS，Thermo Fisher Scientific）中孵育30分鐘進(jìn)行染色，未結(jié)合的染料通過(guò)PBS洗滌后真空過(guò)濾去除。使用熒光顯微鏡（Olympus BX53,Tokyo,Japan）拍攝標(biāo)本的顯微照片。

糖消耗分析

為了確定BNC管培養(yǎng)過(guò)程中的糖消耗，每天取樣液體培養(yǎng)基樣品，并通過(guò)3,5-二硝基水楊酸比色法（DNS法）測(cè)定殘留的果糖或葡萄糖。測(cè)定進(jìn)行三次。

BNC產(chǎn)量測(cè)定

BNC產(chǎn)量記錄每個(gè)純化管在105°C烘箱中干燥至恒重后的干重。平均值從三個(gè)樣品獲得。

BNC管形態(tài)表征

通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM,Hitachi-S4800）檢查BNC管的形態(tài)。將BNC管冷凍干燥并噴鍍碳層。FE-SEM圖像在5.0kV加速電壓下獲得。從SEM圖像中隨機(jī)選擇100根纖維，使用圖像分析軟件Image-J（NIH,USA）測(cè)量纖維直徑。然后根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)計(jì)算平均直徑（MD）和纖維分布。

拉伸強(qiáng)度測(cè)量

將BNC管切成5厘米長(zhǎng)，并在室溫超純水中保存24小時(shí)。拉伸強(qiáng)度測(cè)量參考了標(biāo)準(zhǔn)ISO 7198:1998(E)（已于2016年修訂）中描述的管狀樣品縱向拉伸強(qiáng)度測(cè)試程序。簡(jiǎn)而言之，將BNC管在萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)（H5K,Hounsfield,UK）上用夾具夾住，夾距為3cm，以10mm min-1的速度和50 N傳感器負(fù)載測(cè)量軸向拉伸機(jī)械性能。拉伸測(cè)量進(jìn)行三次。

爆破壓測(cè)量

使用自制設(shè)備測(cè)量爆破壓，該設(shè)備配備壓力表和注射器。將長(zhǎng)度為4厘米的管狀樣品連接到設(shè)備上。以0.01 MPa s-1（75 mm Hg s-1）的速度將超純水注入管內(nèi)直至失效。管內(nèi)壓力每增加0.02 MPa保持10秒。記錄樣品突然破裂時(shí)的壓力。測(cè)量進(jìn)行三次。

透水性測(cè)定

按照ISO 7198:1998(E)標(biāo)準(zhǔn)（已于2016年修訂）描述的方法測(cè)量透水性。簡(jiǎn)而言之，記錄在0.016MPa測(cè)試壓力下，每分鐘透過(guò)BNC管（長(zhǎng)度4厘米）管壁的水的體積。測(cè)量進(jìn)行三次。

管密度測(cè)量

BNC管的密度通過(guò)將管的干重（w）除以濕管的實(shí)際體積（V）來(lái)測(cè)量：w/V[kg m-3]。為了測(cè)量實(shí)際體積，首先將管在20°C水中平衡24小時(shí)。然后將平衡后的管完全浸入放置在10mL量筒（最小刻度0.1 mL）中的5mL水中。管體積根據(jù)量筒中液位的變化獲得。干重在管于105°C干燥至恒重后測(cè)量。管密度的每個(gè)平均值從五個(gè)樣品獲得。

統(tǒng)計(jì)分析

進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）以檢測(cè)收集數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)顯著性。P<0.05表示平均值之間存在顯著差異。