摘要

Moraxella catarrhalis在生物膜中生長時，兩個開放閱讀框（ORFs）aniA和norB顯著上調，它們預測編碼亞硝酸還原酶和一氧化氮還原酶。一個位于aniA和norB之間的ORF被命名為nsrR，預測編碼一個轉錄調控因子。在三個不同的M.catarrhalis菌株中，通過DNA微陣列分析和定量逆轉錄PCR測量，nsrR的失活導致aniA和norB表達增加。在nsrR突變體中提供野生型nsrR基因可減少AniA蛋白表達。DNA微陣列分析顯示，另外兩個ORFs（MC ORF 683和MC ORF 1550）在nsrR突變體中持續上調。與野生型細胞相比，nsrR突變體細胞消耗亞硝酸和一氧化氮的速度更快。然而，低濃度亞硝酸鈉完全抑制了nsrR突變體的生長。這種亞硝酸鹽對生長的抑制在nsrR突變體中引入aniA突變后顯著逆轉，并在trans提供野生型nsrR基因后完全逆轉。NsrR對aniA表達的調控對亞硝酸鹽敏感，而NsrR對norB的調控對一氧化氮敏感。

引言

Moraxella catarrhalis曾被認為是一種無害的共生于人類上呼吸道的微生物，但現在被公認是一種能夠在人類上下呼吸道引起疾病的病原體。在嬰兒和幼兒中，M.catarrhalis是急性中耳炎的常見原因。在成人中，該菌引起的疾病可能呈現更嚴重的形式。它已被證明是慢性阻塞性肺病（COPD）急性加重的重要原因。據估計，美國每年有200萬至400萬COPD加重病例可歸因于M.catarrhalis。COPD是發達國家第四大死因，根據最新估計，到2020年，COPD預計將成為全球第三大死因。

M.catarrhalis在鼻咽黏膜表面的定植能力對其在其他解剖區域引起疾病至關重要，因為這種定植為M.catarrhalis在人類宿主中提供了立足點。事實上，M.catarrhalis在嬰兒期常見于鼻咽部定植，高定植率與中耳炎風險增加相關。迄今為止，M.catarrhalis定植鼻咽黏膜的機制尚未闡明，盡管過去幾年已鑒定出一些可能參與此過程的M.catarrhalis基因產物；這些基因產物基本上都是表面暴露蛋白，具有已證明的粘附活性。在人類鼻咽部，M.catarrhalis很可能與共生細菌一起以生物膜形式存在于黏膜上，最近有報道稱在中耳炎兒童的鼓室黏膜上檢測到M.catarrhalis生物膜。

目前只有少數研究在體外研究了M.catarrhalis的生物膜形成，其中一項研究確定了當該菌以這種方式生長時上調的基因。在生物膜生長期間表達高度上調的基因中，有幾個預測編碼參與將硝酸鹽（NO3?）還原為一氧化二氮（N2O）的蛋白質。這些上調基因包括編碼硝酸還原酶復合物的narGHJI基因簇、編碼亞硝酸還原酶的aniA（也被描述為主要厭氧誘導外膜蛋白）和編碼一氧化氮還原酶的norB。雖然將NO3?還原為亞硝酸鹽（NO2?）的能力是M.catarrhalis的一個已確立特征，可用于鑒定該菌，但上述另外兩種酶的存在表明M.catarrhalis具有表達截短脫氮途徑的潛力，僅缺乏將N2O轉化為氣態氮（N2）的能力。此外，從NO2?產生一氧化氮（NO）以及將NO還原為N2O的能力可能使M.catarrhalis在氧限制條件下更有效地呼吸，并保護自身免受宿主防御機制產生的NO的攻擊。最近對另一種最初定植鼻咽黏膜的病原體腦膜炎奈瑟菌的研究表明，其一氧化氮還原酶可以影響人類細胞中基于NO的信號傳導過程。

在本文中，我們證明M.catarrhalis憑借其AniA和NorB蛋白的表達能夠還原NO2?和NO。我們還顯示，位于aniA和norB基因之間的一個開放閱讀框（ORF）編碼NsrR，一種調控蛋白，控制AniA和NorB的表達水平。M.catarrhalis nsrR基因的失活導致AniA和NorB的過度表達，這與外源添加的NO2?對生長的抑制相關。我們還證明其他幾個M.catarrhalis基因直接或間接受NsrR調控。

材料與方法

細菌菌株和培養條件

本研究使用的M.catarrhalis菌株列于表1。使用的基礎培養基是腦心浸液（BHI）培養基，肉湯培養物在37°C通氣培養。BHI培養基在適當時補充卡那霉素（15μg/ml）或壯觀霉素（15μg/ml）。所有BHI瓊脂平板在37°C、含95%空氣和5%CO2的氣氛中培養。

為測量細菌生長，將細菌在BHI瓊脂上過夜生長，然后懸浮于BHI肉湯中至260 Klett單位密度。取1 ml懸浮液接種到500 ml燒瓶中的20 ml BHI肉湯中，在37°C以200 rpm振蕩培養。每小時測量生長濁度。

新鮮制備的2.5 M NaNO2水溶液經過濾滅菌，在需要時添加到BHI肉湯中至終濃度5 mM。為研究NO對某些M.catarrhalis基因表達的影響，將spermine NONOate添加到細菌培養物中以產生NO。簡要來說，新鮮制備的25 mM spermine NONOate（溶于0.1 M NaOH）經過濾滅菌，添加到對數期培養物中至終濃度50μM。繼續生長45分鐘后，再次添加spermine NONOate至相同終濃度。再生長45分鐘后，收獲細胞用于提取總RNA。對照培養物接收等量的0.1 M NaOH。

全細胞裂解物制備和Western blot分析

全細胞裂解物從BHI瓊脂生長的細胞中制備，如先前所述。Western blot分析按先前所述進行。