體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

大鼠的慢性腦葡萄糖代謝不足。研究在兩組大鼠身上進(jìn)行：對(duì)照組(n=16)和每天靜脈注射2-DG 1個(gè)月后出現(xiàn)慢性腦葡萄糖代謝低下的大鼠(n=21)。2-DG是一種合成的葡萄糖類似物，可與葡萄糖競(jìng)爭(zhēng)，通過(guò)載體介導(dǎo)運(yùn)輸進(jìn)入哺乳動(dòng)物大腦。它還能競(jìng)爭(zhēng)性地磷酸化為2-脫氧葡萄糖-6-磷酸，后者不能被磷酸葡萄糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，從而抑制糖酵解。直接向大腦注射2-DG會(huì)在沒(méi)有全身性低血糖的情況下產(chǎn)生局部細(xì)胞葡萄糖減少癥，并排除糖酵解抑制對(duì)其他器官的潛在負(fù)面影響。我們?cè)谀X室內(nèi)注射了2.5μl的2-DG溶液(20mM)(8.2微克)。腦脊液的總體積約為90μl，假定腦脊液中的2-DG擴(kuò)散速度很快(部分由附膜細(xì)胞的纖毛促進(jìn))，2-DG的最終濃度為0.56毫摩爾，分布均勻。由于2-DG在大鼠大腦中通過(guò)細(xì)胞外液(ECF)傳輸?shù)郊?xì)胞的體積僅為1μl，因此我們可以假設(shè)最終ECF中的2-DG濃度也將等于0.56毫摩爾。成年大鼠海馬的ECF葡萄糖濃度約為1.3mM。2-DG和葡萄糖共享相同的膜運(yùn)輸系統(tǒng)，但糖酵解速率的限制因素是己糖激酶的活性。相對(duì)糖酵解率可按下式計(jì)算：

U=Umax[Glu]/([Glu]+Km(1+[2-DG]/Ki)

葡萄糖磷酸化的邁克爾常數(shù)(Km)為0.07mM，2-DG的抑制常數(shù)(Ki)為0.3mM。因此，注射2.5微升20mM 2-DG溶液會(huì)導(dǎo)致糖酵解抑制率達(dá)到14%。動(dòng)物以注射0.9%NaCl溶液(2.5微升)作為對(duì)照。

靜脈注射藥物4周后，一組大鼠用于LFP記錄和隨后的核磁共振分析，另一組大鼠用于戊四唑(PTZ)測(cè)試和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。在體外實(shí)驗(yàn)中，在最后一次注射2-DG/vehicle約12小時(shí)后提取大腦。

立體定向手術(shù)。大鼠在佐萊地爾(24毫克/千克，i.m.)和賽拉嗪(12毫克/千克，i.m.)的靜注麻醉下進(jìn)行手術(shù)。使用漢密爾頓注射器進(jìn)行靜脈注射給藥時(shí)，將導(dǎo)管浸入側(cè)腦室(AP=-0.8；L=1.0；H=3.0)。為了記錄海馬LFPs，在同側(cè)海馬前部齒狀回區(qū)域(AP=-3.6；L=2.0；H=3.6)植入了100微米薄鎳鉻絕緣電極。參比電極被擰入枕骨。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)間不早于術(shù)后一周。用于體外實(shí)驗(yàn)(n=8)和PTZ試驗(yàn)(n=12)的動(dòng)物只植入了導(dǎo)引插管。

LFP記錄。自由移動(dòng)大鼠的LFP被放大、濾波(高通濾波器0.1Hz，數(shù)字化頻率5kHz)，并使用DataPack2k軟件(RUN Technologies)進(jìn)行存儲(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方案：在幾天的對(duì)照期內(nèi)記錄LFPs，然后每天服用藥物或2-DG。每只大鼠每3天記錄一次。在整個(gè)給藥期間都記錄LFPs。

所有記錄均在清醒、自由活動(dòng)的動(dòng)物中進(jìn)行，這些動(dòng)物被關(guān)在自己的籠子里(以盡量減少狀態(tài)變化帶來(lái)的壓力)，并被放置在法拉第籠中。每次記錄之前，動(dòng)物都要經(jīng)過(guò)15分鐘的實(shí)驗(yàn)條件適應(yīng)期。記錄時(shí)間為10：00至15：00。每次實(shí)驗(yàn)的平均持續(xù)時(shí)間約為2.5小時(shí)。在記錄過(guò)程中，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)和控制，使其保持清醒。進(jìn)一步分析表明，在不同行為狀態(tài)下(如躺臥或漫步)記錄的LFPs沒(méi)有明顯差異。這種無(wú)差異可能是由于環(huán)境因素造成的，例如完全沒(méi)有外部刺激(熟悉的小圍欄、孤獨(dú)、統(tǒng)一的背景、缺乏食物/飲料、一天中不活動(dòng)的時(shí)間)。因此，在各種行為狀態(tài)下記錄的LFPs都集中在一起進(jìn)行分析。隨后，將大腦在液氮中快速冷凍，用于核磁共振分析。

LFP分析。為了評(píng)估高振幅尖峰的數(shù)量和持續(xù)時(shí)間，記錄的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)是從遠(yuǎn)離刺激區(qū)域的足夠長(zhǎng)的基礎(chǔ)活動(dòng)期(>3分鐘)中計(jì)算出來(lái)的。程序掃描蹤跡，在50至990毫秒的持續(xù)時(shí)間范圍內(nèi)選擇所有高于等于5 SD的閾值水平的事件。

為了評(píng)估超過(guò)基礎(chǔ)水平的LFP活動(dòng)(累積活動(dòng))，我們采用了以下步驟：將LFP記錄歸一化為SD，并將閾值設(shè)為3 SD。程序掃描蹤跡并選擇所有高于閾值水平的事件。所有負(fù)事件均被反轉(zhuǎn)。之后，程序計(jì)算每個(gè)連續(xù)時(shí)間段內(nèi)的事件峰值總和。由于LFP記錄已歸一化，因此可對(duì)每組動(dòng)物的累積活動(dòng)進(jìn)行平均。

為了比較高頻猝發(fā)(HFB)事件，該算法掃描了在60到600Hz范圍內(nèi)過(guò)濾的LFP記錄，并選擇了所有超過(guò)7 RMS(基線均方根)閾值的事件。從這些事件中，進(jìn)一步分析在100至250Hz和250至600Hz濾波跡線中超過(guò)7 RMS閾值的事件。只有由五個(gè)以上振蕩組成的事件才會(huì)被考慮進(jìn)行分析。以前也曾使用過(guò)類似的程序。為了檢測(cè)和評(píng)估自發(fā)性癲癇發(fā)作，我們使用計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析LFP記錄，其選擇限制如下：癲癇發(fā)作閾值為基線的7 RMS；掃描窗口(5秒)中超過(guò)閾值的振蕩次數(shù)不少于10；最短癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間為10秒。

PTZ敏感性測(cè)試。為了研究動(dòng)物對(duì)亞驚厥劑量的PTZ(35毫克/千克)的敏感性，我們將動(dòng)物分為兩組，分別是經(jīng)空白載體處理的動(dòng)物(n=6)和經(jīng)2-DG處理的動(dòng)物(n=6)。最初，在手術(shù)和慢性手術(shù)前注射PTZ以測(cè)試對(duì)照組的反應(yīng)。在靜注2-DG(或?qū)φ沼幂d體)治療4周后，再次注射亞驚厥PTZ。在最后一次注射2-DG/空白載體24小時(shí)后進(jìn)行PTZ測(cè)試。根據(jù)W.Fischer和H.Kittner的研究，根據(jù)行為模式對(duì)癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)估。Kittner的研究：無(wú)發(fā)作(0期)；微弱點(diǎn)頭(0.5期)；耳朵、臉部和眼瞼抽搐(1期)；輕度前肢陣攣(1.5期)；肌陣攣性身體抽搐，前肢陣攣性抽搐(無(wú)后仰)(2期)；部分后仰和前肢快速陣攣性發(fā)作(2.5)；強(qiáng)力雙側(cè)前肢陣攣，伴有完全仰臥(10秒)(第3期)；仰臥和跌倒，伴有強(qiáng)力雙側(cè)前肢陣攣(第3.5期)；全身陣攣性發(fā)作，伴有仰臥-跌倒發(fā)作或跳躍(第4期)；全身陣攣-強(qiáng)直發(fā)作，伴有右側(cè)反射失敗(第4.5期)；全身陣攣-強(qiáng)直發(fā)作和癲癇狀態(tài)(2分鐘)(第5期)。

通過(guò)核磁共振測(cè)量腦代謝物。大鼠的整個(gè)頭部在斷頭后被冷凍在液氮中。眾所周知，這種技術(shù)能保留部分而非全部易變代謝物，但由于斷頭后的易變代謝物水平取決于自溶而非神經(jīng)元興奮性，因此檢測(cè)到的變化仍能可靠地與已發(fā)展的病理狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。

完全冷凍后，在-15℃溫度下放置1小時(shí)，然后提取、破碎大腦并保存在液氮中。在冷凍樣本中加入等重量的氯仿(CDCl3)和700微升D2O，在振動(dòng)器中用玻璃球勻漿30秒，然后在15000g轉(zhuǎn)速下離心5分鐘。在540μl上清液中加入60微升4μM的3三甲基硅基[2,2,3,3-2H4]丙酸酯(TSP)D2O溶液，攪拌后放入NMR管中。1D和2D COSY圖譜是在一臺(tái)AVANCE III 600 NMR光譜儀上記錄的，該光譜儀使用標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列，質(zhì)子頻率為600MHz，管徑為5毫米，溫度為298°K。通過(guò)使用ZGPR 1D脈沖序列進(jìn)行預(yù)飽和，實(shí)現(xiàn)了水抑制。采集次數(shù)為128次掃描，掃描間隔為10秒，足以滿足所有觀察到的代謝物的質(zhì)子弛豫。在3.41秒內(nèi)對(duì)96個(gè)K點(diǎn)進(jìn)行了自由誘導(dǎo)衰變登記，光譜寬度為24ppm，90°脈沖為11μsec，并在填充零點(diǎn)后對(duì)128個(gè)K點(diǎn)進(jìn)行了傅里葉變換。化學(xué)位移的校準(zhǔn)是以0.00ppm的TSP信號(hào)作為內(nèi)部參考。二維COSY序列COSYGPPRQF被用于細(xì)化峰值分配。利用布魯克公司"AMIX"軟件的光譜數(shù)據(jù)庫(kù)以及公共數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB(人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù))對(duì)核磁共振光譜中的所有重要信號(hào)進(jìn)行了識(shí)別，并將其分配給代謝物。針對(duì)核磁共振光譜中最重要的信號(hào)，計(jì)算了大鼠大腦中代謝物的相對(duì)濃度(即總可溶性化合物的分?jǐn)?shù))。為便于展示，將每種代謝物濃度歸一化為個(gè)體最小值與最大值之差(%max-min)，并繪制成組均值±SEM。光譜處理和積分計(jì)算由布魯克公司的"TOPSPIN"程序進(jìn)行。