圖5生物過程基因本體注釋分析與電子傳遞鏈和TCA循環(huán)途徑。A，與生物過程相關(guān)的基因本體注釋分析的二維氣泡圖。圖中顯示了主要生物過程(圓圈)與外泌體中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)經(jīng)FDR校正后的-Log10P值的對(duì)比圖。圓圈的大小和顏色與每個(gè)生物過程相關(guān)蛋白質(zhì)的數(shù)量成正比。B，在電子傳遞鏈和TCA循環(huán)途徑中，用紅色標(biāo)出外泌體中富集的該生物過程的蛋白質(zhì)，用淺灰色標(biāo)出在文獻(xiàn)尿液外泌體中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。

在外泌體中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)具有特定的多樣性，這可能意味著這些蛋白質(zhì)具有不同的功能。為了評(píng)估這一點(diǎn)，我們使用細(xì)胞圖譜軟件進(jìn)行了基于生物過程注釋的基因本體分析。外泌體的生物過程中至少有20%的相關(guān)基因，且經(jīng)FDR校正后P≤0.05的值被認(rèn)為是顯著的。基因本體分析確定了384個(gè)重要的頂級(jí)基因特征(數(shù)據(jù)未顯示)。圖5顯示了生物過程基因本體注釋分析的二維氣泡圖，突出顯示了尿液外泌體中存在的主要生物過程。這些過程包括：運(yùn)輸、免疫系統(tǒng)過程、細(xì)胞分化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞粘附、細(xì)胞骨架組織、囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞凋亡調(diào)控、蛋白水解、組織相關(guān)miRNA含量和新陳代謝。事實(shí)上，有趣的是，大多數(shù)基因名稱特征與氧化代謝有關(guān)，其中葡萄糖代謝顯著豐富，從而包括TCA循環(huán)和呼吸電子鏈(圖5A)。特別是，TCA循環(huán)酶(ACO2是唯一的例外)和103個(gè)呼吸鏈蛋白中有34個(gè)被鑒定出來。盡管如此，如圖5B所示，這34個(gè)蛋白質(zhì)代表了所有五種呼吸鏈復(fù)合物。

圖6尿液外泌體的耗氧量和ATP合成。A顯示了尿液外泌體中氧氣消耗。加入0.7mM NADH可刺激由復(fù)合物I、III和IV形成的途徑。為了抑制這一途徑，加入了40μM的魚藤酮(復(fù)合物I的抑制劑)。然后，為了誘導(dǎo)由復(fù)合物II、III和IV組成的途徑，加入20mM丁二酸，并使用50μM抗霉素A(復(fù)合物III的抑制劑)來停止反應(yīng)。耗氧量以μM O2表示。B是與NADH或琥珀酸的耗氧量比較。數(shù)據(jù)以nmol O/min/mg表示。

這些意想不到的發(fā)現(xiàn)表明，尿液外泌體特別富含有氧代謝蛋白質(zhì)，因此我們開始評(píng)估這些蛋白質(zhì)在氧化磷酸化(OXPHOS)過程中是否活躍。為了評(píng)估這一點(diǎn)，我們?cè)u(píng)估了尿液外泌體的耗氧量和ATP合成。實(shí)驗(yàn)是在沒有去污劑的情況下進(jìn)行的，以檢測(cè)表面的OXPHOS。圖6A顯示了尿液外泌體呼吸作用圖，在加入NADH誘導(dǎo)由復(fù)合物I、III和IV組成的呼吸途徑，或加入琥珀酸激活由復(fù)合物II、III和IV組成的呼吸途徑之后，尿液外泌體的呼吸作用發(fā)生了變化。之所以選擇NADH作為呼吸底物，是因?yàn)樗兄趨^(qū)分線粒體呼吸和線粒體外呼吸(我們之前已經(jīng)證明了這一點(diǎn))，因?yàn)樗鼘?duì)作為呼吸底物的離體線粒體無滲透性。圖6A顯示，尿液外泌體消耗氧氣的方式分別受到復(fù)合體I和III抑制劑魚藤酮和抗霉素A的抑制。有趣的是，存在琥珀酸時(shí)的呼吸速率高于存在NADH時(shí)的呼吸速率，這也如圖6B所示。這證實(shí)了耗氧量不是由于線粒體污染造成的，因?yàn)樵谶@些細(xì)胞器中，復(fù)合體I、III和IV的途徑通常比復(fù)合體II、III和IV組成的途徑更有效。為了評(píng)估尿液外泌體中的耗氧量是否最終轉(zhuǎn)化為ATP合成，我們?cè)贜ADH存在下檢測(cè)了ATP合成活性。ATP合成在反應(yīng)的前2分鐘呈線性(數(shù)據(jù)未顯示)。P/O比約為2.4±0.3，表明氧消耗與ATP合成相關(guān)聯(lián)。

圖7外泌體蛋白質(zhì)二維電泳圖譜。A，外泌體總蛋白的代表性銀染色；B，生物素化的外泌體表面蛋白；C，ATP5B的Western印跡檢測(cè)。用抗ATP5B檢測(cè)FoF1-ATP合酶beta亞基后觀察到的斑點(diǎn)與觀察生物素化外泌體蛋白后觀察到的一些斑點(diǎn)重疊，表明這些斑點(diǎn)代表了外泌體表面特異表達(dá)的一種蛋白。

為了證實(shí)呼吸電子鏈復(fù)合物在外泌體表面表達(dá)，我們使用EZ-linksulfo-NHS-LC-LC生物素酯對(duì)膜表面蛋白進(jìn)行化學(xué)共軛，并對(duì)呼吸電子鏈復(fù)合物中的一個(gè)蛋白即ATP合成酶β亞基(ATP5B)進(jìn)行了免疫檢測(cè)。EZlinksulfo-NHS-LC-LC生物素酯是一種細(xì)胞滲透性氨基反應(yīng)劑，廣泛用于標(biāo)記暴露在活細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)。此外，生物素與中性印跡蛋白的結(jié)合是已知最強(qiáng)的非共價(jià)相互作用之一，是使用HRP結(jié)合物中性印跡蛋白特異性檢測(cè)生物素化蛋白質(zhì)的有力工具。因此，只有那些暴露在表面并被生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)才會(huì)被揭示出來。在這里，生物素化的外泌體被裂解并通過二維凝膠電泳(2-DE)分離。將等量的裂解液轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用HRP連接的中性葡萄蛋白檢測(cè)，并與銀染色的相同裂解液進(jìn)行比較。通過比較總蛋白圖譜(圖7A)和生物素化蛋白圖譜(圖7B)，可以發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的數(shù)量和組成存在很大差異。這一結(jié)果與外泌體表面蛋白生物素化的高度特異性是一致的。

此外，在檢測(cè)抗-ATP5B后獲得的同一裂解液圖像(圖7C)中也出現(xiàn)了一個(gè)斑點(diǎn)，其位置與生物素化外泌體蛋白可視化后觀察到的位置相同，這表明這些斑點(diǎn)代表了特異性存在于外泌體表面的蛋白質(zhì)種類。

4討論

測(cè)定健康尿液的蛋白質(zhì)組成可加深對(duì)腎臟生理的了解，并建立一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，用于比較正常尿液和各種腎臟疾病患者的尿液。在本研究中，為了進(jìn)一步加深對(duì)健康尿液蛋白質(zhì)組的了解，我們使用了12份尿液樣本來鑒定水溶性尿瘤(2473個(gè)蛋白質(zhì))和外泌體(1951個(gè)蛋白質(zhì))的蛋白質(zhì)組成。采用的方法是順序取樣法，這種方法可以生成尿液蛋白質(zhì)組圖譜，該圖譜由子餾分構(gòu)建，突出了具有不同化學(xué)物理特性的蛋白質(zhì)，如高度疏水性蛋白質(zhì)(沉淀餾分)、微弱蛋白質(zhì)(珠子餾分)和來自不同納米囊泡的蛋白質(zhì)(外泌體餾分)。這樣還可以將尿瘤體與其外泌體進(jìn)行比較。盡管樣品制備技術(shù)需要更多的工作和時(shí)間，但CPLL-bead處理方法發(fā)現(xiàn)了大部分新鑒定的蛋白質(zhì)，證實(shí)了發(fā)現(xiàn)階段的實(shí)用性，有助于生成健康的尿液蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。

為了更好地了解兩種樣本之間蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，我們將尿液收集對(duì)象限定為年齡在35-45歲之間的健康捐獻(xiàn)者，從而減少了生物變異；由于尿液蛋白質(zhì)組會(huì)隨時(shí)間發(fā)生明顯變化，我們還收集了相同的尿液(第二次晨尿)。此外，考慮到觀察到的生物變異，我們收集了足夠的簡(jiǎn)單樣本量，以確定尿瘤和外泌體之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的兩倍變化，P=0.05，功率為80%。

在我們之前的研究中，我們利用兩個(gè)第二晨尿集合樣本，在四個(gè)水溶性組分中鑒定出2251個(gè)蛋白質(zhì)，在外泌體組分中鑒定出1615個(gè)蛋白質(zhì)。在本研究中，我們?cè)诿總€(gè)組分中鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)量與本研究和之前的其他研究相當(dāng)。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)分析，我們?cè)谀蛄龊屯饷隗w部分之間發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)不同的樣本群，其內(nèi)部同質(zhì)性很高。外泌體表達(dá)的779個(gè)蛋白質(zhì)與人類尿液外泌體數(shù)據(jù)庫(kù)重疊，1615個(gè)蛋白質(zhì)與之前的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)重疊。因此，在我們的研究中鑒定出的蛋白質(zhì)中有83%是人類外泌體的已知成分，這證實(shí)了本研究對(duì)尿液外泌體進(jìn)行了充分的分離。大多數(shù)外泌體蛋白為細(xì)胞質(zhì)或膜蛋白，少數(shù)為細(xì)胞外蛋白。這一結(jié)果似乎并不令人驚訝，因?yàn)檫@些納米囊泡在形成和排泄過程中會(huì)吸收細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)和微核糖核酸。

此外，外泌體蛋白質(zhì)組分析表明，蛋白質(zhì)圍繞特定功能聚集。特別是，本研究報(bào)告了外泌體的一個(gè)有趣特征，即這些外泌體表達(dá)與代謝功能相關(guān)的蛋白質(zhì)。我們以前曾對(duì)這一事實(shí)進(jìn)行過研究，認(rèn)為外泌體中表達(dá)的與新陳代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)可能是功能性的。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，通過蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)尿液外泌體中表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后得出的預(yù)測(cè)是可靠的。此外，顯示尿液外泌體中有氧呼吸過程功能的數(shù)據(jù)與人類臍帶胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的數(shù)據(jù)一致。外泌體獨(dú)立于線粒體進(jìn)行有氧呼吸，而線粒體從未接觸過中微粒體。深入研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞和尿液中的外泌體代表了從本體到廢液的連續(xù)統(tǒng)一體的兩個(gè)極端，這表明進(jìn)行有氧呼吸的能力可能是外泌體的共同特征，進(jìn)一步的研究可能會(huì)證實(shí)這一點(diǎn)。

組裝線粒體ETC復(fù)合物需要復(fù)雜的導(dǎo)入和折疊機(jī)制，很難設(shè)想外泌體也有這種機(jī)制。相反，由于外泌體的生物生成過程從未與線粒體接觸過，因此外泌體所產(chǎn)生的MVB很可能吸收了線粒體內(nèi)膜的蛋白質(zhì)。考慮到OXPHOS機(jī)器是在線粒體中組裝的，形成了一種被稱為超級(jí)復(fù)合物的超微結(jié)構(gòu)，我們假設(shè)這種超分子結(jié)構(gòu)由于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的異源融合而轉(zhuǎn)移到了外泌體中。值得注意的是，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的聯(lián)系并不新鮮。一些研究報(bào)告稱，這兩個(gè)細(xì)胞區(qū)室之間存在磷脂交換。支持這一觀點(diǎn)的事實(shí)是，線粒體在細(xì)胞中形成了一個(gè)動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)，盡管線粒體被認(rèn)為是一個(gè)半獨(dú)立的動(dòng)力室，但它們與細(xì)胞的其他部分相連，可以進(jìn)行新陳代謝交換和交流。有人研究了線粒體和ER通過特定蛋白質(zhì)(稱為MAM(線粒體相關(guān)膜))的相互作用。

這一網(wǎng)絡(luò)似乎是維持細(xì)胞平衡、生物能和存活的基礎(chǔ)，最終決定了細(xì)胞在應(yīng)激條件下的命運(yùn)。在過去的幾年中，我們中的一些人描述了一些組織中異位OXPHOS的活動(dòng)，這些活動(dòng)是由線粒體中的相同蛋白質(zhì)執(zhí)行的。此外，其他作者也報(bào)告了OXPHOS的異位功能表達(dá)。進(jìn)一步的研究可能會(huì)評(píng)估我們報(bào)告的外泌體代謝活動(dòng)的生理意義。

尿液是一種具有挑戰(zhàn)性的環(huán)境，但我們還是分離出了保留其特殊蛋白質(zhì)成分的外泌體。分離方法反過來又會(huì)對(duì)分離出的外泌體的完整性產(chǎn)生重大影響。尿液外泌體蛋白質(zhì)組分析的額外分離步驟可通過不同的分離程序?qū)崿F(xiàn)。我們這里采用的超速離心法被認(rèn)為是分離外泌體的首選方法，也是純化外泌體用于分離后分析的最常用方法。

數(shù)據(jù)表明，尿液蛋白質(zhì)互補(bǔ)研究將受益于對(duì)外泌體的關(guān)注，因?yàn)橥饷隗w的蛋白質(zhì)比總尿液中的蛋白質(zhì)保存得更有效。尿液及其外泌體有一個(gè)顯著的優(yōu)勢(shì)，即可以通過非侵入性或微侵入性的方式輕松獲取，其數(shù)量原則上不受限制。另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以搜索生物標(biāo)記物的表達(dá)，即可以識(shí)別其來自腎臟系統(tǒng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)。事實(shí)上，大多數(shù)尿液蛋白質(zhì)都包含在囊泡中。發(fā)現(xiàn)腎衰竭的早期標(biāo)志物尤為重要，因?yàn)榇蠖鄶?shù)腎臟疾病的臨床表現(xiàn)都較晚。外泌體可能濃縮了可通過免疫分離的生物標(biāo)志物。此外，對(duì)分離出的外泌體中的RNA含量進(jìn)行研究也可作為一種診斷工具：例如，有報(bào)告稱這可用于癌癥診斷。

5總結(jié)

總之，我們?yōu)榱私饨】的蛞旱鞍踪|(zhì)組的各種成分做出了貢獻(xiàn)，繪制了人類健康尿瘤與外泌體相比的詳細(xì)蛋白質(zhì)組圖譜。此外，我們的外泌體蛋白質(zhì)組圖譜顯示，這些蛋白質(zhì)聚集在特定功能周圍，其中一個(gè)功能與有氧代謝有關(guān)。數(shù)據(jù)顯示了尿液外泌體中呼吸鏈復(fù)合物和TCA循環(huán)酶的功能表達(dá)。