Effect of polyphenolic phytochemicals on ectopic oxidative phosphorylation in rod outer segments of bovine retina

多酚類(lèi)植物化學(xué)物質(zhì)對(duì)牛視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞外節(jié)異位氧化磷酸化的影響

來(lái)源：British Journal of Pharmacology, Volume172, Issue15, August 2015, Pages 3890-3903

《英國(guó)藥理學(xué)雜志》，第172卷第15期，2015年8月，第3890-3903頁(yè)

 

摘要

摘要指出視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞外節(jié)是進(jìn)行光轉(zhuǎn)導(dǎo)的特化細(xì)胞器，其中功能性地表達(dá)著線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I-IV、細(xì)胞色素c和FoF1-ATP合酶。本研究探討了白藜蘆醇、姜黃素加胡椒堿、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和槲皮素等多酚類(lèi)化合物（作為線粒體ATP酶/合酶抑制劑）對(duì)視桿細(xì)胞外節(jié)異位FoF1-ATP合酶活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇和姜黃素加胡椒堿抑制了外節(jié)中的ATP合成和耗氧量；EGCG和槲皮素抑制了外節(jié)中的ATP水解和耗氧量。在有底物存在時(shí)，呼吸中的外節(jié)會(huì)產(chǎn)生丙二醛和過(guò)氧化氫。細(xì)胞色素c位于盤(pán)膜內(nèi)部，并且外節(jié)中表達(dá)procaspase 9、procaspase 3以及Apaf-1。結(jié)論是這些多酚類(lèi)植物化學(xué)物質(zhì)通過(guò)調(diào)節(jié)外節(jié)FoF1-ATP合酶活性，減少了由外節(jié)異位電子傳遞鏈產(chǎn)生的活性氧中間體，從而可能保護(hù)視網(wǎng)膜免受強(qiáng)光照射所致氧化應(yīng)激的功能損傷。

 

研究目的

本研究旨在探究多酚類(lèi)化合物是否能調(diào)節(jié)牛視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞外節(jié)中存在的異位FoF1-ATP合酶的活性，并研究其對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡機(jī)制的影響，特別是細(xì)胞色素c、caspase 9、caspase 3和Apaf-1的表達(dá)，以闡明這些化合物在視網(wǎng)膜退行性疾病中的潛在保護(hù)機(jī)制。

 

研究思路

研究從新鮮牛視網(wǎng)膜制備純化的視桿細(xì)胞外節(jié)。利用半定量Western blotting、共聚焦和電子顯微鏡以及細(xì)胞熒光術(shù)，結(jié)合生化分析（如測(cè)氧法、ATP合成和水解測(cè)定）來(lái)評(píng)估多種多酚化合物（白藜蘆醇、姜黃素、EGCG、槲皮素等）對(duì)外節(jié)中ATP合酶/酶活性、耗氧量、活性氧產(chǎn)生以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。整體思路是從分子定位到功能驗(yàn)證，探討多酚化合物通過(guò)調(diào)控異位氧化磷酸化系統(tǒng)發(fā)揮作用的可能性。

 

測(cè)量的數(shù)據(jù)及研究意義

1. ATP合酶表達(dá)定位數(shù)據(jù)：免疫金TEM和Western blot證實(shí)ATP合酶β亞基與視紫紅質(zhì)在外節(jié)共定位。研究意義在于確認(rèn)FoF1-ATP合酶在視桿細(xì)胞外節(jié)盤(pán)膜上的異位表達(dá)，為后續(xù)功能研究提供基礎(chǔ)。數(shù)據(jù)來(lái)自圖1和圖2。

 

 

2. ATP合成活性數(shù)據(jù)：外節(jié)勻漿物能合成ATP，該活性可被寡霉素和白藜蘆醇顯著抑制。姜黃素與胡椒堿聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)ATP合成的抑制呈濃度依賴(lài)性增強(qiáng)。研究意義在于證明外節(jié)存在功能性ATP合成能力，且可被多酚化合物調(diào)控，提示其作為能量來(lái)源的作用及干預(yù)靶點(diǎn)。數(shù)據(jù)來(lái)自圖3和圖4。

 

 

3. ATP水解活性數(shù)據(jù)：EGCG和槲皮素以濃度依賴(lài)的方式抑制外節(jié)ATP水解。研究意義在于揭示多酚化合物能特異性影響ATP合酶的逆向功能（水解活性），可能影響外節(jié)能量穩(wěn)態(tài)。數(shù)據(jù)來(lái)自圖5。

 

4. 耗氧量數(shù)據(jù)：多酚化合物（姜黃素+胡椒堿、EGCG、槲皮素）顯著抑制了由底物刺激的外節(jié)耗氧量。研究意義在于直接將多酚化合物的作用與異位氧化磷酸過(guò)程的氧消耗聯(lián)系起來(lái)，證明其抑制整體代謝活性。數(shù)據(jù)來(lái)自圖6。

 

5. 活性氧和氧化損傷數(shù)據(jù)：外節(jié)在呼吸底物存在下產(chǎn)生過(guò)氧化氫，并且NADH存在時(shí)丙二醛（脂質(zhì)過(guò)氧化標(biāo)志物）產(chǎn)量增加。研究意義在于證實(shí)外節(jié)異位電子傳遞鏈?zhǔn)腔钚匝醯膩?lái)源，可能導(dǎo)致盤(pán)膜氧化損傷。數(shù)據(jù)來(lái)自表2。

 

6. 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)：細(xì)胞色素c位于盤(pán)膜內(nèi)部，并且外節(jié)表達(dá)procaspase 9、procaspase 3和Apaf-1。研究意義在于提示外節(jié)具備內(nèi)在的caspase依賴(lài)性凋亡機(jī)制，氧化損傷可能導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放并觸發(fā)凋亡。數(shù)據(jù)來(lái)自圖7、圖8和圖9。

 

 

 

 

結(jié)論

1. 多酚類(lèi)植物化學(xué)物質(zhì)（白藜蘆醇、姜黃素、EGCG、槲皮素）能有效調(diào)制牛視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞外節(jié)中異位表達(dá)的FoF1-ATP合酶的活性，分別抑制其ATP合成或ATP水解功能。

2. 這些化合物同時(shí)抑制外節(jié)的耗氧量，表明它們能影響外節(jié)的異位氧化磷酸化過(guò)程。

3. 多酚化合物通過(guò)抑制異位電子傳遞鏈的功能，減少了活性氧中間體的產(chǎn)生，從而可能降低盤(pán)膜脂質(zhì)的過(guò)氧化損傷。

4. 外節(jié)盤(pán)膜內(nèi)存在細(xì)胞色素c以及procaspase 9、procaspase 3、Apaf-1等凋亡相關(guān)蛋白，提示氧化損傷可能導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放并啟動(dòng)caspase依賴(lài)性凋亡通路，而多酚化合物的抗氧化作用可能干擾這一過(guò)程。

5. 研究結(jié)果支持多酚化合物通過(guò)靶向視網(wǎng)膜光感受器外節(jié)的異位能量代謝系統(tǒng)，在對(duì)抗氧化應(yīng)激相關(guān)視網(wǎng)膜病變（如年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變）中發(fā)揮保護(hù)作用的假說(shuō)。

 

使用丹麥Unisense電極測(cè)量數(shù)據(jù)的研究意義

研究中使用了丹麥Unisense公司的測(cè)氧儀（oxygraph apparatus）及其配套的電流計(jì)電極（amperometric electrode）來(lái)測(cè)量視桿細(xì)胞外節(jié)制備物的耗氧量。具體方法是將外節(jié)樣品（40 μg蛋白/1.7 mL）在密閉反應(yīng)室中于23°C下測(cè)量，反應(yīng)介質(zhì)含有HEPES緩沖液、KCl、MgCl2、KH2PO4等，并加入呼吸底物NADH和琥珀酸鹽。使用特定的MicOx軟件將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為Excel文件進(jìn)行分析。

其研究意義在于：第一，直接證實(shí)了純化的視桿細(xì)胞外節(jié)制備物具有耗氧能力，這為“外節(jié)存在異位氧化磷酸化系統(tǒng)”這一創(chuàng)新假設(shè)提供了關(guān)鍵的直接證據(jù)，因?yàn)楹难跏茄趸姿峄^(guò)程的標(biāo)志。第二，通過(guò)顯示多酚化合物（姜黃素+胡椒堿、EGCG、槲皮素）能顯著抑制ADP刺激下的耗氧量（抑制率達(dá)61%-78%），將多酚化合物的生物化學(xué)效應(yīng)（抑制ATP合酶）與細(xì)胞器水平的整體代謝活性（氧化磷酸化）直接聯(lián)系起來(lái)，證明了其調(diào)制作用的功能相關(guān)性。第三，該測(cè)量是在嚴(yán)格控制條件下（如加入腺苷酸激酶抑制劑Ap5A）對(duì)相對(duì)純凈的外節(jié)制備物進(jìn)行的，有助于將觀察到的耗氧現(xiàn)象歸因于外節(jié)本身而非可能的線粒體污染，增強(qiáng)了結(jié)果的可靠性。第四，耗氧量抑制的數(shù)據(jù)與ATP合成/水解抑制的數(shù)據(jù)相互印證，共同構(gòu)建了多酚化合物通過(guò)抑制ATP合酶活性→影響氧化磷酸化過(guò)程→減少電子傳遞鏈漏泄→降低活性氧產(chǎn)生的完整作用通路。因此，Unisense電極獲得的耗氧量數(shù)據(jù)是連接分子靶點(diǎn)抑制與潛在生理病理意義（減少氧化應(yīng)激）的關(guān)鍵橋梁。