Specific nanotoxicity of graphene oxide during zebrafish embryogenesis

氧化石墨烯在斑馬魚胚胎發(fā)生期間的特定納米毒性

來(lái)源：Nanotoxicology, Volume 10, Issue 1, 2016, Pages 42-52

《納米毒理學(xué)》，第10卷第1期，2016年，第42-52頁(yè)

 

摘要

摘要指出氧化石墨烯（GO）在生物、醫(yī)學(xué)、能源和電子領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用潛力，但其釋放到生態(tài)系統(tǒng)中的風(fēng)險(xiǎn)未知，尤其對(duì)胚胎發(fā)生關(guān)鍵期的影響。研究發(fā)現(xiàn)GO通過(guò)羥基相互作用附著和包裹斑馬魚胚胎絨毛膜，阻塞絨毛膜孔道，導(dǎo)致顯著缺氧和孵化延遲。GO還能自發(fā)滲透絨毛膜，通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入胚胎，損傷線粒體，并主要轉(zhuǎn)移到眼、心臟和卵黃囊等循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)區(qū)域，誘發(fā)過(guò)量活性氧生成、氧化應(yīng)激、DNA損傷和細(xì)胞凋亡。GO還引起眼畸形、心包/卵黃囊水腫、尾彎曲和心率降低等發(fā)育異常。與常見(jiàn)納米顆粒的劑量效應(yīng)關(guān)系不同，GO對(duì)心率和尾/脊髓彎曲的影響隨濃度增加先增后減，強(qiáng)調(diào)了GO對(duì)胚胎發(fā)生的特定 adverse effects 及潛在生態(tài)和健康風(fēng)險(xiǎn)。

 

研究目的

本研究旨在表征GO納米片與斑馬魚胚胎的相互作用，分析GO在體內(nèi)的定位和 adverse effects。具體目標(biāo)包括：確定GO對(duì)胚胎絨毛膜的包裹作用及其導(dǎo)致的缺氧效應(yīng)；GO向胚胎特定器官的轉(zhuǎn)運(yùn)；以及過(guò)量ROS生成、細(xì)胞凋亡、DNA損傷和發(fā)育畸形之間的關(guān)系。

 

研究思路

研究使用斑馬魚胚胎模型，將胚胎暴露于不同濃度GO（0.01-100 mg/L）的E3培養(yǎng)液中。通過(guò)多種技術(shù)分析GO的特性（如AFM、TEM、FT-IR），觀察GO對(duì)絨毛膜的包裹（SEM）、缺氧微環(huán)境（Unisense氧微傳感器）、GO的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)（激光共聚焦顯微鏡、TEM、拉曼光譜），并測(cè)量生理指標(biāo)（死亡率、孵化率、心率、自發(fā)運(yùn)動(dòng)、畸形）和生化指標(biāo)（凋亡、ROS、氧化應(yīng)激、基因毒性）。整體思路是從GO-胚胎相互作用表征到體內(nèi)毒性機(jī)制驗(yàn)證。

 

測(cè)量的數(shù)據(jù)及研究意義

1. GO表征數(shù)據(jù)：包括Zeta電位、AFM顯示的厚度（0.8-1 nm）、尺寸分布（101-258 nm）、FT-IR顯示的官能團(tuán)（如-OH、C=O）。研究意義在于確認(rèn)GO的物理化學(xué)性質(zhì)，為后續(xù)毒性機(jī)制提供基礎(chǔ)。數(shù)據(jù)來(lái)自圖1。

 

2. GO包裹絨毛膜和缺氧微環(huán)境數(shù)據(jù)：SEM顯示GO覆蓋絨毛膜表面并阻塞孔道（圖2B）；FT-IR顯示絨毛膜官能團(tuán)變化（如C-OH增加）；Unisense氧微傳感器測(cè)量顯示，隨GO濃度增加（1-100 mg/L），絨毛膜附近氧濃度顯著降低（如100 mg/L時(shí)從271 μM降至227 μM）。研究意義在于證明GO包裹導(dǎo)致物理性缺氧，是孵化延遲和發(fā)育異常的直接原因。數(shù)據(jù)來(lái)自圖2A、2B、2C。

 

3. GO攝取和線粒體損傷數(shù)據(jù)：激光共聚焦顯微鏡顯示GO-F在8分鐘內(nèi)進(jìn)入胚胎，主要定位于卵黃囊（圖3A）；TEM顯示GO通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入胚胎，損傷線粒體（膜腫脹）（圖3B、3E、3F）；拉曼光譜證實(shí)胚胎內(nèi)GO聚集（圖3G）。研究意義在于揭示GO能穿透生物屏障，通過(guò)內(nèi)吞途徑引起細(xì)胞器損傷，為氧化應(yīng)激提供機(jī)制解釋。數(shù)據(jù)來(lái)自圖3A-G。

 

4. 生理指標(biāo)數(shù)據(jù)：GO引起孵化延遲（100 mg/L時(shí)孵化率<30%）、心率變化（1 mg/L時(shí)降低，100 mg/L時(shí)增加）、自發(fā)運(yùn)動(dòng)抑制（100 mg/L）和畸形（如心包水腫、尾彎曲）。研究意義在于顯示GO對(duì)胚胎發(fā)育的特定影響，如非單調(diào)劑量效應(yīng)，提示缺氧和直接毒性共同作用。數(shù)據(jù)來(lái)自圖4A-D。

 

5. 凋亡和氧化應(yīng)激數(shù)據(jù)：GO增加眼、心臟和尾部區(qū)域凋亡（圖5A、5B）和ROS生成（圖6A、6B）；SOD活性降低，MDA含量增加。研究意義在于將GO定位與局部毒性關(guān)聯(lián)，證實(shí)氧化應(yīng)激是核心機(jī)制。數(shù)據(jù)來(lái)自圖5A-B、圖6A-B。

 

 

6. 基因毒性數(shù)據(jù)：GO增加8-OHdG水平（DNA氧化損傷），并復(fù)雜影響DNA甲基化（1 mg/L抑制，100 mg/L促進(jìn)）。研究意義在于揭示GO可能通過(guò)表觀遺傳機(jī)制導(dǎo)致發(fā)育異常。

 

結(jié)論

1. GO通過(guò)包裹絨毛膜導(dǎo)致物理性缺氧，引起孵化延遲和發(fā)育異常。

2. GO能滲透胚胎，主要積累在眼、心臟和卵黃囊等區(qū)域，通過(guò)內(nèi)吞作用損傷線粒體，誘發(fā)氧化應(yīng)激、凋亡和畸形。

3. GO毒性顯示特定劑量效應(yīng)（如心率和尾彎曲非單調(diào)變化），與缺氧和直接物理?yè)p傷相關(guān)。

4. GO引起DNA損傷和甲基化改變，強(qiáng)調(diào)其潛在生態(tài)和健康風(fēng)險(xiǎn)。

 

使用丹麥Unisense電極測(cè)量數(shù)據(jù)的研究意義

研究中使用了丹麥Unisense公司的氧微傳感器（Clark型）測(cè)量斑馬魚胚胎絨毛膜附近的氧氣濃度。具體方法是將傳感器插入絨毛膜深度0-250 μm處，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)氧分壓。結(jié)果顯示，在對(duì)照組中，絨毛膜附近氧濃度為271 μM，而隨著GO濃度增加（1、10、100 mg/L），氧濃度顯著降低至244、243和227 μM（圖2C），表明GO包裹絨毛膜阻塞孔道，導(dǎo)致缺氧微環(huán)境。這一測(cè)量的研究意義在于：第一，直接量化了GO引起的物理性缺氧程度，為孵化延遲和自發(fā)運(yùn)動(dòng)減弱提供了機(jī)制解釋（如缺氧抑制胚胎活動(dòng)）；第二，通過(guò)空間分辨率（深度變化）證實(shí)缺氧是局部效應(yīng)，而非全身性，強(qiáng)化了GO包裹的直接作用；第三，與去絨毛膜實(shí)驗(yàn)對(duì)比（補(bǔ)充圖S6），排除GO直接毒性干擾，突顯包裹的主導(dǎo)角色；第四，缺氧數(shù)據(jù)與發(fā)育指標(biāo)（如心率變化）關(guān)聯(lián)，提示GO毒性可能通過(guò)缺氧放大。總之，Unisense電極的高精度測(cè)量（微米級(jí)分辨率）關(guān)鍵地證明了GO的物理屏障效應(yīng)，是連接材料性質(zhì)與生物學(xué)響應(yīng)的核心證據(jù)。