Gel-Entrapped Staphylococcus aureus Bacteria as Models of Biofilm Infection Exhibit Growth in Dense Aggregates, Oxygen Limitation, Antibiotic Tolerance, and Heterogeneous Gene Expression

凝膠包埋的金黃色葡萄球菌作為生物膜感染模型表現(xiàn)出密集聚集體生長(zhǎng)、氧限制、抗生素耐受和異質(zhì)性基因表達(dá)

來(lái)源：Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Volume 60, Issue 10, October 2016, pages 6294-6301

《抗菌劑與化療》，第60卷第10期，2016年10月，第6294-6301頁(yè)

 

摘要

摘要闡述了研究開發(fā)了一種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停M體內(nèi)生物膜感染的結(jié)構(gòu)和特征，如發(fā)生在肺部或皮膚傷口中無(wú)生物材料表面的感染。該模型通過將金黃色葡萄球菌包埋在瓊脂糖凝膠中，形成分散在凝膠基質(zhì)中的細(xì)胞聚集體，模擬了黏液或宿主基質(zhì)材料中的生物膜結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，細(xì)菌形成離散的聚集體，隨時(shí)間擴(kuò)大并出現(xiàn)大小梯度；凝膠中包埋24小時(shí)的細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，對(duì)苯唑西林、米諾環(huán)素或環(huán)丙沙星的敏感性遠(yuǎn)低于浮游細(xì)胞；氧濃度隨凝膠深度增加而下降，在500μm深處降至空氣飽和度的3%以下；乳酸脫氫酶報(bào)告基因在低氧區(qū)域被誘導(dǎo)表達(dá)。表明該凝膠模型捕獲了生物膜感染的關(guān)鍵特征：密集聚集體形成、生長(zhǎng)速率降低、局部缺氧和抗生素耐受。

 

研究目的

研究目的是提供一種模擬無(wú)生物材料表面生物膜感染的模型，如囊性纖維化肺或慢性傷口中的感染，其中微生物生物膜以細(xì)胞聚集體形式分散在黏液或受損組織中。通過表征凝膠包埋金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)、空間組織、抗生素耐受性、微尺度氧濃度梯度和細(xì)菌生理活動(dòng)，驗(yàn)證該模型能否再現(xiàn)體內(nèi)生物膜的關(guān)鍵特性。

 

研究思路

研究思路是使用金黃色葡萄球菌菌株AH2547和UAMS-1，制備瓊脂糖凝膠包埋的細(xì)菌模型，將凝膠填充到玻璃毛細(xì)管中，在稀釋的TSB培養(yǎng)基中孵育長(zhǎng)達(dá)30小時(shí)。通過活菌計(jì)數(shù)、共聚焦顯微鏡、氧微電極測(cè)量和報(bào)告基因表達(dá)分析，評(píng)估細(xì)菌生長(zhǎng)、聚集體形態(tài)、氧濃度梯度、抗生素耐受性和基因表達(dá)異質(zhì)性。實(shí)驗(yàn)包括比較浮游和凝膠包埋細(xì)菌的抗生素殺傷效果，使用Unisense氧微電極測(cè)量氧剖面，并利用ldh::gfp報(bào)告基因監(jiān)測(cè)缺氧響應(yīng)。

 

測(cè)量的數(shù)據(jù)及研究意義

1 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線數(shù)據(jù)：通過活菌計(jì)數(shù)和圖像分析測(cè)量凝膠中金黃色葡萄球菌隨時(shí)間的變化。研究意義：顯示細(xì)菌在凝膠中初始快速生長(zhǎng)后速率降低，模擬體內(nèi)生物膜的慢生長(zhǎng)特性，與囊性纖維化痰液中的細(xì)菌生長(zhǎng)率相似。數(shù)據(jù)來(lái)自圖2和圖4。

 

 

2 聚集體形態(tài)和大小梯度數(shù)據(jù)：共聚焦顯微鏡圖像顯示細(xì)菌形成密集聚集體，且大小隨深度增加而減小。研究意義：證實(shí)模型再現(xiàn)了體內(nèi)生物膜的空間異質(zhì)性，聚集體大小梯度反映了營(yíng)養(yǎng)和氧的擴(kuò)散限制。數(shù)據(jù)來(lái)自圖3和圖5。

 

 

3 抗生素耐受性數(shù)據(jù)：比較浮游細(xì)菌、2小時(shí)和24小時(shí)凝膠包埋細(xì)菌對(duì)苯唑西林、米諾環(huán)素和環(huán)丙沙星的殺傷效果。研究意義：凝膠包埋細(xì)菌表現(xiàn)出顯著抗生素耐受，耐受因子達(dá)2.8-10.5，模擬了生物膜感染的耐藥特性。數(shù)據(jù)來(lái)自圖6。

 

4 氧濃度剖面數(shù)據(jù)：使用Unisense氧微電極測(cè)量凝膠內(nèi)部的氧分壓隨深度變化。研究意義：直接證實(shí)凝膠內(nèi)存在氧梯度，在500μm深處變?yōu)槿毖酰С至松锬ぶ腥毖跷h(huán)境的假設(shè)。數(shù)據(jù)來(lái)自圖7。

 

5 基因表達(dá)異質(zhì)性數(shù)據(jù)：使用ldh::gfp報(bào)告基因監(jiān)測(cè)乳酸脫氫酶表達(dá)，顯示在凝膠內(nèi)部區(qū)域表達(dá)增強(qiáng)。研究意義：驗(yàn)證了缺氧生理響應(yīng)，基因表達(dá)模式與預(yù)測(cè)的氧梯度一致，體現(xiàn)了生物膜的生理異質(zhì)性。數(shù)據(jù)來(lái)自圖8和圖9。

 

 

 

 

結(jié)論

1 凝膠包埋金黃色葡萄球菌模型成功模擬了體內(nèi)生物膜感染的關(guān)鍵特征，包括密集聚集體形成、生長(zhǎng)速率降低、局部缺氧和抗生素耐受。

2 氧濃度梯度和缺氧響應(yīng)基因表達(dá)證實(shí)了模型中的代謝異質(zhì)性，與體內(nèi)生物膜觀察一致。

3 該模型為研究無(wú)固體附著表面生物膜感染提供了實(shí)用工具，有助于理解慢性感染機(jī)制和開發(fā)治療方法。

 

使用丹麥Unisense電極測(cè)量數(shù)據(jù)的研究意義

使用丹麥Unisense氧微電極（Clark風(fēng)格，尖端直徑10μm）測(cè)量凝膠內(nèi)部的氧濃度剖面，研究意義在于提供了高空間分辨率的氧分壓量化，直接驗(yàn)證了生物膜模型中的擴(kuò)散限制和缺氧微環(huán)境。電極通過兩點(diǎn)校準(zhǔn)（空氣飽和和無(wú)氧介質(zhì)），確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。測(cè)量顯示氧濃度隨深度增加而指數(shù)下降，在500μm深處降至接近零，證實(shí)了反應(yīng)-擴(kuò)散相互作用導(dǎo)致的氧限制。這種缺氧條件驅(qū)動(dòng)了細(xì)菌的代謝適應(yīng)，如乳酸脫氫酶表達(dá)上調(diào)，模擬了體內(nèi)生物膜的生理狀態(tài)。Unisense電極的精確測(cè)量支持了模型在模擬慢性感染（如囊性纖維化肺或慢性傷口）中缺氧環(huán)境的有效性，為研究生物膜耐受機(jī)制提供了關(guān)鍵生理參數(shù)。此外，氧梯度數(shù)據(jù)與抗生素耐受和基因表達(dá)異質(zhì)性關(guān)聯(lián)，強(qiáng)化了模型在轉(zhuǎn)化研究中的實(shí)用性。