Phenazines regulate Nap-dependent denitrification in Pseudomonas aeruginosa biofilms

吩嗪調(diào)控銅綠假單胞菌生物膜中Nap依賴的反硝化作用

來源 Journal of Bacteriology, Vol. 200, No. 9，2018

《細(xì)菌學(xué)雜志》，第200卷第9期，2018年

 

摘要

本研究探討了銅綠假單胞菌生物膜中吩嗪對(duì)反硝化作用的調(diào)控機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在好氧條件下生長(zhǎng)的吩嗪缺失突變株生物膜中，即使沒有硝酸鹽存在，反硝化相關(guān)基因也會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)。這表明細(xì)胞采用了一種"賭注對(duì)沖"策略來預(yù)期硝酸鹽的可用性，以平衡其高度還原的氧化還原狀態(tài)。被誘導(dǎo)的反硝化途徑結(jié)合了周質(zhì)硝酸還原酶Nap和下游的亞硝酸還原酶Nir、一氧化氮還原酶Nor和一氧化二氮還原酶Nos。這種調(diào)控關(guān)系不同于以膜結(jié)合硝酸還原酶Nar為主的厭氧反硝化途徑。研究還發(fā)現(xiàn)反硝化途徑的不同步驟在好氧生長(zhǎng)的生物膜中不同深度被催化，表明群落亞群之間存在代謝交叉喂養(yǎng)。

 

研究目的

本研究旨在闡明吩嗪如何調(diào)控銅綠假單胞菌生物膜中的反硝化作用，特別是Nap依賴的反硝化途徑。具體目標(biāo)是探究吩嗪缺失如何誘導(dǎo)反硝化基因表達(dá)，揭示這種調(diào)控的分子機(jī)制，并理解反硝化過程在生物膜空間結(jié)構(gòu)中的分布特征。

 

研究思路

研究使用銅綠假單胞菌PA14的野生型、吩嗪缺失突變株和吩嗪過表達(dá)株，在好氧條件下培養(yǎng)菌落生物膜。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析比較不同菌株的蛋白表達(dá)差異。構(gòu)建GFP報(bào)告株監(jiān)測(cè)反硝化基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。通過啟動(dòng)子區(qū)域突變和序列分析鑒定調(diào)控元件。使用丹麥Unisense氧微電極測(cè)量生物膜內(nèi)部的氧濃度剖面。通過薄層切片和共聚焦顯微鏡觀察基因表達(dá)的空間分布。結(jié)合液體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，評(píng)估不同氧條件和硝酸鹽對(duì)基因表達(dá)的影響。

 

測(cè)量的數(shù)據(jù)及研究意義

1 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)：顯示吩嗪缺失突變株中反硝化酶表達(dá)上調(diào)。數(shù)據(jù)來自圖1。研究意義在于表明吩嗪缺失能誘導(dǎo)反硝化途徑，即使在沒有硝酸鹽的情況下，提示細(xì)胞氧化還原狀態(tài)可直接調(diào)控反硝化基因表達(dá)。

 

 

2 GFP報(bào)告基因表達(dá)數(shù)據(jù)：顯示nap和nir在吩嗪缺失突變株中表達(dá)升高，尤其在低氧條件下。數(shù)據(jù)來自圖3、4。研究意義在于證實(shí)吩嗪調(diào)控反硝化基因轉(zhuǎn)錄，且這種調(diào)控受氧條件影響，揭示了環(huán)境信號(hào)整合機(jī)制。

 

 

3 啟動(dòng)子突變分析數(shù)據(jù)：發(fā)現(xiàn)nap啟動(dòng)子的-35到-10區(qū)域?qū)Ψ脏好舾行灾匾鴑ir啟動(dòng)子的Anr/Dnr結(jié)合位點(diǎn)是調(diào)控關(guān)鍵。數(shù)據(jù)來自圖6、7。研究意義在于揭示了吩嗪通過特定轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控反硝化基因的分子基礎(chǔ)，Anr可能作為氧化還原傳感器。

 

 

4 氧分布剖面數(shù)據(jù)：使用丹麥Unisense氧微電極測(cè)量生物膜深度方向的氧濃度。數(shù)據(jù)來自圖8B。研究意義在于精確刻畫了生物膜內(nèi)部的氧梯度，顯示上部富氧、下部缺氧的微環(huán)境，為理解基因空間表達(dá)提供環(huán)境背景。

 

5 空間表達(dá)分布數(shù)據(jù)：薄層切片顯示nap在生物膜上部高表達(dá)，nir在下部高表達(dá)。數(shù)據(jù)來自圖8A。研究意義在于表明反硝化途徑的不同步驟在空間上分離，暗示亞群間通過代謝物交換進(jìn)行合作。

 

結(jié)論

1 吩嗪缺失會(huì)誘導(dǎo)Nap依賴的反硝化途徑，這可能是細(xì)胞應(yīng)對(duì)氧化還原失衡的賭注對(duì)沖策略。

2 吩嗪通過影響轉(zhuǎn)錄因子如Anr來調(diào)控反硝化基因表達(dá)，不同吩嗪種類具有差異調(diào)控效果。

3 反硝化酶在生物膜不同深度呈現(xiàn)空間分離表達(dá)，這種分布有利于群落水平的代謝分工與合作。

4 生物膜微環(huán)境的異質(zhì)性與吩嗪信號(hào)共同調(diào)控反硝化作用，體現(xiàn)了微生物群落的代謝靈活性。

 

使用丹麥Unisense電極測(cè)量數(shù)據(jù)的研究意義

本研究使用丹麥Unisense公司生產(chǎn)的氧微電極測(cè)量生物膜內(nèi)部的氧濃度剖面，這一技術(shù)具有重要的研究意義。首先，該微電極具有高空間分辨率，能夠以微米級(jí)精度刻畫生物膜從表層到底部的氧梯度，準(zhǔn)確顯示好氧、微好氧和厭氧區(qū)域的分布。測(cè)量數(shù)據(jù)顯示，生物膜上部氧濃度較高，隨深度增加而逐漸降低，底部呈現(xiàn)缺氧狀態(tài)。這種詳細(xì)的氧分布圖為理解反硝化基因的空間表達(dá)模式提供了關(guān)鍵環(huán)境背景。其次，通過比較野生型和吩嗪缺失突變株的氧剖面，發(fā)現(xiàn)兩者氧分布相似，但基因表達(dá)差異顯著，這直接證明吩嗪對(duì)反硝化基因的調(diào)控主要是通過影響細(xì)胞氧化還原狀態(tài)而非改變氧分布來實(shí)現(xiàn)的。此外，氧微電極數(shù)據(jù)與基因表達(dá)空間數(shù)據(jù)結(jié)合，清晰揭示了nap基因在富氧區(qū)表達(dá)、nir基因在缺氧區(qū)表達(dá)的模式，突出了生物膜內(nèi)微環(huán)境異質(zhì)性對(duì)代謝途徑空間組織的決定性作用。總之，Unisense氧微電極的應(yīng)用為從空間尺度理解生物膜代謝調(diào)控提供了可靠的技術(shù)支撐。