Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis

天然反義轉(zhuǎn)錄本與玉米黑粉菌線粒體功能調(diào)節(jié)及休眠孢子休眠性相關(guān)

來(lái)源：Molecular Microbiology[2017] 103[5], 745-763

《分子微生物學(xué)》，2017年，第103卷，第5期，第745-763頁(yè)

 

摘要

這篇論文研究了在玉米黑粉菌Ustilago maydis中，天然反義轉(zhuǎn)錄本（NATs）如何調(diào)節(jié)線粒體功能和冬孢子休眠。重點(diǎn)關(guān)注了as-ssm1 NAT，它互補(bǔ)于線粒體絲氨酸-tRNA合成酶基因（ssm1）。通過(guò)異位表達(dá)as-ssm1，發(fā)現(xiàn)它導(dǎo)致生長(zhǎng)率、毒力、線粒體膜電位和氧消耗減少，并形成雙鏈RNA，增加ssm1轉(zhuǎn)錄水平但不改變蛋白質(zhì)水平。這表明as-ssm1通過(guò)dsRNA形成和減少線粒體功能來(lái)促進(jìn)冬孢子休眠。

 

研究目的

研究目的是探究NATs在調(diào)節(jié)線粒體功能和冬孢子休眠中的作用，特別是在U. maydis中。旨在驗(yàn)證NATs通過(guò)調(diào)節(jié)核編碼的線粒體蛋白基因表達(dá)來(lái)調(diào)控代謝休眠的假說(shuō)，并闡明as-ssm1在休眠過(guò)程中的具體功能。

 

研究思路

研究思路包括：首先通過(guò)EST庫(kù)和RNA-seq分析識(shí)別在冬孢子中特異性表達(dá)的NATs，特別是針對(duì)線粒體相關(guān)基因的NATs；選擇as-ssm1作為候選NAT，因其在冬孢子中高表達(dá)；通過(guò)異位表達(dá)as-ssm1在單倍體細(xì)胞中研究其功能；評(píng)估其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、致病性、線粒體功能等的影響；使用分子生物學(xué)方法檢測(cè)dsRNA形成和轉(zhuǎn)錄/蛋白質(zhì)水平變化；并比較相關(guān)物種以驗(yàn)證保守性。

 

測(cè)量的數(shù)據(jù)及研究意義

1. NATs表達(dá)模式：通過(guò) strand-specific RT-PCR 檢測(cè) as-ssm1 在冬孢子中的特異性表達(dá)，以及其在植物感染時(shí)間過(guò)程中的出現(xiàn)時(shí)機(jī)。來(lái)自圖1、圖3、圖4。研究意義：證實(shí)NATs在休眠階段特異性表達(dá)，支持其參與休眠調(diào)節(jié)的假說(shuō)。

 

 

 

2. ssm1基因重要性：通過(guò)刪除實(shí)驗(yàn)顯示ssm1是細(xì)胞存活所必需的，缺失導(dǎo)致細(xì)胞裂解。來(lái)自圖5。研究意義：表明ssm1對(duì)線粒體功能和細(xì)胞完整性關(guān)鍵，間接支持NATs可能通過(guò)調(diào)節(jié)此類(lèi)基因影響休眠。

 

 

3. as-ssm1表達(dá)對(duì)ssm1 mRNA的影響：異位表達(dá)as-ssm1增加ssm1轉(zhuǎn)錄水平并形成dsRNA。來(lái)自圖6A和6B。研究意義：提示NATs可能通過(guò)dsRNA穩(wěn)定mRNA，在休眠中保存轉(zhuǎn)錄本以供萌發(fā)時(shí)快速翻譯。

 

 

4. 生長(zhǎng)率和致病性：as-ssm1表達(dá)降低細(xì)胞生長(zhǎng)率和植物感染中的毒力。來(lái)自圖7A和7B。研究意義：表明NATs表達(dá)可模擬休眠狀態(tài)下的代謝減緩，支持其參與發(fā)育調(diào)節(jié)。

 

 

5. 冬孢子發(fā)育：as-ssm1表達(dá)延遲冬孢子形成。來(lái)自圖8。研究意義：證實(shí)NATs在休眠過(guò)渡中起作用，影響發(fā)育時(shí)間線。

 

 

6. 線粒體膜電位：使用MitoTracker染色顯示as-ssm1表達(dá)降低膜電位。來(lái)自圖9A。研究意義：直接顯示線粒體功能受損，與休眠的低代謝一致。

 

 

7. 氧消耗率：使用Clark-type微呼吸計(jì)（丹麥Unisense電極）測(cè)量顯示as-ssm1表達(dá)降低氧消耗。來(lái)自圖9B。研究意義：定量證明呼吸作用減少，強(qiáng)化NATs在抑制代謝中的角色。

8. Ssm1蛋白質(zhì)水平：Western blot顯示as-ssm1表達(dá)不改變蛋白質(zhì)水平。來(lái)自圖10。研究意義：表明NATs可能通過(guò)翻譯干擾而非蛋白質(zhì)降解調(diào)節(jié)功能，提示RNA介導(dǎo)的機(jī)制。

 

 

結(jié)論

論文得出結(jié)論：as-ssm1 NAT通過(guò)形成dsRNA和可能通過(guò)RNA介導(dǎo)的機(jī)制調(diào)節(jié)線粒體功能，從而促進(jìn)冬孢子休眠。NATs在休眠入口和維持中起關(guān)鍵作用，通過(guò)可逆地穩(wěn)定mRNA并抑制翻譯，使細(xì)胞在萌發(fā)時(shí)快速恢復(fù)代謝。該研究支持NATs作為重要調(diào)節(jié)因子在真菌發(fā)育過(guò)程中的作用。

 

使用丹麥Unisense電極測(cè)量數(shù)據(jù)的研究意義

使用丹麥Unisense電極（Clark-type微呼吸計(jì)）測(cè)量的氧消耗數(shù)據(jù)（來(lái)自圖9B）顯示，as-ssm1表達(dá)菌株的氧消耗率比野生型低1.4倍。這一數(shù)據(jù)的研究意義在于：它直接定量地證明了線粒體呼吸功能受損，為NATs降低代謝活動(dòng)提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。氧消耗減少與休眠狀態(tài)的低呼吸率一致，支持as-ssm1通過(guò)抑制氧化磷酸化來(lái)誘導(dǎo)代謝暫停的假說(shuō)。此外，該方法的高靈敏度允許精確檢測(cè)細(xì)微的呼吸變化，強(qiáng)化了NATs在調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝中的功能性角色，并為理解休眠的分子機(jī)制提供了關(guān)鍵指標(biāo)。