Shigella-mediated oxygen depletion is essential for intestinal mucosa colonization

福氏志賀氏菌介導(dǎo)的氧氣耗竭對(duì)于腸道黏膜定植至關(guān)重要

來(lái)源：Nature Microbiology, volume 4, pages 2001–2009 (2019)

《自然-微生物學(xué)》，第4卷，第2001–2009頁(yè)（2019年）

 

摘要

這篇論文的摘要闡述了福氏志賀氏菌在腸道定植過(guò)程中，通過(guò)其有氧呼吸主動(dòng)消耗組織中的氧氣，導(dǎo)致感染灶局部缺氧。這種缺氧環(huán)境并非主要由宿主中性粒細(xì)胞引起，而是由細(xì)菌自身造成。研究還發(fā)現(xiàn)，三型分泌系統(tǒng)在感染組織中失活，促進(jìn)了細(xì)菌以定植灶形式聚集（定植者）而非擴(kuò)散（探索者），從而優(yōu)化了其在感染過(guò)程中的定植能力。這表明病原體通過(guò)操縱組織氧合水平來(lái)適應(yīng)不斷變化的微環(huán)境是其成功定植的關(guān)鍵策略。

 

研究目的

本研究旨在闡明腸道病原菌，特別是以福氏志賀氏菌為模型，在腸道黏膜定植過(guò)程中如何主動(dòng)調(diào)節(jié)局部組織的氧氣水平，以及這種調(diào)節(jié)對(duì)其定植策略和宿主免疫反應(yīng)的影響。具體目的是驗(yàn)證細(xì)菌有氧呼吸是否是其造成感染灶缺氧的主要原因，并探究缺氧環(huán)境如何影響細(xì)菌行為（如三型分泌系統(tǒng)活性）和感染結(jié)局。

 

研究思路

研究思路首先利用體內(nèi)感染模型（豚鼠結(jié)腸感染）和缺氧報(bào)告分子EF5，證實(shí)福氏志賀氏菌感染確實(shí)會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸黏膜形成缺氧灶。然后，通過(guò)單細(xì)胞水平的定量成像分析，將細(xì)菌（分為聚集菌和分散菌）和中性粒細(xì)胞的位置與局部缺氧水平進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。為了區(qū)分細(xì)菌和宿主中性粒細(xì)胞在耗氧過(guò)程中的相對(duì)貢獻(xiàn)，研究在正常和中性粒細(xì)胞減少的動(dòng)物模型中進(jìn)行比較，并輔以體外實(shí)驗(yàn)，使用丹麥Unisense電極精確測(cè)量不同密度細(xì)菌及其與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)的氧氣消耗動(dòng)力學(xué)。進(jìn)一步，通過(guò)構(gòu)建福氏志賀氏菌細(xì)胞色素氧化酶突變株（ΔcydAB 和 ΔappCB），在體內(nèi)外驗(yàn)證特定有氧呼吸鏈組分（bd-I型細(xì)胞色素氧化酶CydAB）在耗氧和毒力中的關(guān)鍵作用。最后，利用三型分泌系統(tǒng)活性報(bào)告菌株，評(píng)估體內(nèi)感染灶中細(xì)菌的T3SS活性，從而將缺氧環(huán)境與細(xì)菌定植策略（聚集 vs. 擴(kuò)散）聯(lián)系起來(lái)。

 

測(cè)量的數(shù)據(jù)及研究意義

1.  組織缺氧水平：使用缺氧報(bào)告分子EF5免疫檢測(cè)，測(cè)量感染組織中不同深度（從上皮表面到黏膜下層）的缺氧程度，以及圍繞單個(gè)聚集菌和分散菌的局部缺氧水平。意義在于直接證明了福氏志賀氏菌感染會(huì)在黏膜層形成特定的缺氧灶，且缺氧與細(xì)菌的聚集狀態(tài)密切相關(guān)。數(shù)據(jù)主要來(lái)自圖1a, b, d, e, f。

 

2.  細(xì)菌和中性粒細(xì)胞的空間分布與密度：通過(guò)定量圖像分析，定位單個(gè)細(xì)菌和中性粒細(xì)胞，計(jì)算聚集菌和分散菌的局部密度以及中性粒細(xì)胞的密度。意義在于揭示了細(xì)菌主要以高密度聚集灶形式存在，并且中性粒細(xì)胞被招募至聚集灶附近。這為分析耗氧來(lái)源提供了空間背景。數(shù)據(jù)來(lái)自圖1c, g, h，圖2c, d。

 

3.  氧氣消耗速率：使用丹麥Unisense氧化電極，在體外模擬生理氧分壓（40 mmHg）下，測(cè)量不同密度的福氏志賀氏菌及其突變株、其他病原菌以及細(xì)菌與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)的氧氣消耗動(dòng)力學(xué)。意義在于定量地證明了高密度細(xì)菌（模擬體內(nèi)聚集灶密度）能迅速耗盡氧氣，且其耗氧能力遠(yuǎn)超中性粒細(xì)胞，從而確定細(xì)菌有氧呼吸是體內(nèi)缺氧形成的主要驅(qū)動(dòng)力。數(shù)據(jù)來(lái)自圖2e, f, g，圖3b，4e。

 

 

4.  細(xì)菌有氧呼吸關(guān)鍵基因的功能：通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞色素氧化酶突變株，評(píng)估其體外耗氧能力、生長(zhǎng)特性及體內(nèi)定植和致病力。意義在于在分子水平上確定了bd-I型細(xì)胞色素氧化酶（CydAB）是福氏志賀氏菌耗氧和體內(nèi)缺氧灶形成所必需的，從而將特定分子機(jī)制與表型聯(lián)系起來(lái)。數(shù)據(jù)來(lái)自圖3a, b, c, d, e。

5.  三型分泌系統(tǒng)活性：使用T3SS活性報(bào)告質(zhì)粒（pTSAR），在體內(nèi)感染灶中于單細(xì)菌水平檢測(cè)T3SS的活性。意義在于發(fā)現(xiàn)感染灶內(nèi)大多數(shù)細(xì)菌的T3SS處于失活狀態(tài)，這解釋了缺氧環(huán)境如何抑制細(xì)菌的擴(kuò)散能力，從而促進(jìn)其以聚集灶形式定植和擴(kuò)展。數(shù)據(jù)來(lái)自圖4a, b, c, d, e。

6.  競(jìng)爭(zhēng)指數(shù)和宿主反應(yīng)標(biāo)志物：通過(guò)共感染實(shí)驗(yàn)比較野生株與突變株在體內(nèi)外的生存優(yōu)勢(shì)，并檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子GLUT1的表達(dá)。意義在于證實(shí)了在野生株創(chuàng)造的低氧環(huán)境下，呼吸缺陷株也能定植，進(jìn)一步支持了細(xì)菌介導(dǎo)的缺氧對(duì)定植至關(guān)重要；同時(shí)GLUT1的上調(diào)是組織缺氧的間接證據(jù)。數(shù)據(jù)來(lái)自圖3f, g。

 

結(jié)論

1.  福氏志賀氏菌通過(guò)其有氧呼吸（主要依賴bd-I型細(xì)胞色素氧化酶CydAB）主動(dòng)消耗感染灶周圍的氧氣，導(dǎo)致結(jié)腸黏膜局部形成缺氧微環(huán)境，這是其關(guān)鍵的定植策略。

2.  中性粒細(xì)胞在福氏志賀氏菌感染引起的組織缺氧中貢獻(xiàn)有限，細(xì)菌本身是氧氣耗竭的主要驅(qū)動(dòng)因素。

3.  感染灶內(nèi)的缺氧條件抑制了福氏志賀氏菌三型分泌系統(tǒng)的活性，限制了細(xì)菌向鄰近宿主細(xì)胞的擴(kuò)散，反而促進(jìn)了細(xì)菌以聚集灶的形式進(jìn)行局部擴(kuò)增和定植。

4.  病原菌對(duì)變化氧水平的適應(yīng)能力（兼性厭氧特性）對(duì)其在宿主體內(nèi)的成功定植和致病至關(guān)重要。

5.  病原菌、共生菌群和宿主細(xì)胞之間對(duì)氧氣的競(jìng)爭(zhēng)（"呼吸之戰(zhàn)"）可能深刻影響感染的結(jié)果。

 

使用丹麥Unisense電極測(cè)量數(shù)據(jù)的研究意義

使用丹麥Unisense氧化電極進(jìn)行的高精度氧氣測(cè)量在本研究中具有關(guān)鍵的研究意義。首先，它提供了直接的、定量的證據(jù)，將體外控制的細(xì)菌密度與氧氣消耗速率直接關(guān)聯(lián)起來(lái)，令人信服地證明在模擬體內(nèi)感染灶的高細(xì)菌密度下，福氏志賀氏菌能在極短時(shí)間內(nèi)（約2.3分鐘）完全耗盡環(huán)境中的氧氣。這一體外動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)有力地支持了體內(nèi)觀察到的缺氧灶是由細(xì)菌自身呼吸造成的假設(shè)。其次，通過(guò)比較細(xì)菌單獨(dú)培養(yǎng)與細(xì)菌和中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)的耗氧曲線，該技術(shù)清晰地揭示了在病原性密度下，細(xì)菌的耗氧占絕對(duì)主導(dǎo)地位，中性粒細(xì)胞的貢獻(xiàn)相對(duì)微小，從而成功區(qū)分了宿主和病原體在耗氧過(guò)程中的相對(duì)作用。第三，利用該技術(shù)對(duì)細(xì)胞色素氧化酶突變株的耗氧能力進(jìn)行表征，在分子機(jī)制層面確認(rèn)了bd-I型氧化酶（CydAB）是耗氧功能的主要執(zhí)行者，將基因型與表型（耗氧能力、毒力）直接聯(lián)系起來(lái)。最后，這些精確的體外測(cè)量數(shù)據(jù)為理解體內(nèi)復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象（如缺氧灶的形成）提供了堅(jiān)實(shí)的定量基礎(chǔ)，使研究結(jié)論更加可靠和深入?？傊?，Unisense電極的應(yīng)用使得研究能夠超越相關(guān)性描述，建立起從細(xì)菌密度到耗氧動(dòng)力學(xué)，再到體內(nèi)定植效果的因果關(guān)系，是本研究得出核心結(jié)論的關(guān)鍵技術(shù)支撐。